Pruebas fenotípicas de micobacterias

En microbiología , el análisis fenotípico de micobacterias emplea diversos métodos. A continuación, se describen las pruebas fenotípicas más utilizadas para identificar y diferenciar cepas y especies de Mycobacterium .

Acetamida como única fuente de C y N

Medio de cultivo : _{KH₂PO₄ (} 0,5 g), MgSO₄· _7H₂O ( _0,5 g), agar purificado (20 g), agua destilada (1000 ml). El medio se suplementa con acetamida hasta una concentración final de 0,02 M, se ajusta a un pH de 7,0 y se esteriliza en autoclave a 115 °C durante 30 minutos. Tras la siembra , el medio se inocula con una asa de los cultivos y se incuba. El crecimiento se lee después de dos semanas de incubación (crecimiento rápido) o cuatro semanas (crecimiento lento). ^{[ 1 ]}

prueba de arilsulfatasa

La enzima arilsulfatasa está presente en la mayoría de las micobacterias. La velocidad a la que esta enzima descompone el disulfato de fenolftaleína en fenolftaleína (que forma un color rojo en presencia de bicarbonato de sodio) y otras sales se utiliza para diferenciar ciertas cepas de micobacterias. La prueba de arilsulfatasa de 3 días se utiliza para identificar micobacterias de crecimiento rápido potencialmente patógenas, como M. fortuitum y M. chelonae. Las micobacterias de crecimiento lento M. marinum y M. szulgai dan positivo en la prueba de arilsulfatasa de 14 días. ^{[ 2 ]}

Catalasa, actividad semicuantitativa

La mayoría de las micobacterias producen la enzima catalasa , pero la cantidad producida varía. Además, algunas formas de catalasa se inactivan al calentarlas a 68 °C durante 20 minutos (otras son estables). Los organismos que producen la enzima catalasa tienen la capacidad de descomponer el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno libre. La prueba difiere de la utilizada para detectar la catalasa en otros tipos de bacterias, ya que emplea peróxido de hidrógeno al 30 % en una solución de detergente fuerte ( polisorbato 80 al 10 % ). ^{[ 1 ]}

Citrato

Única fuente de carbono ^{[ 1 ]}

Huevo mediano

Crecimiento en medio Löwenstein-Jensen (medio LJ)

L-glutamato

Única fuente de carbono y nitrógeno ^{[ 1 ]}

Índice de crecimiento

La tasa de crecimiento es el tiempo necesario para formar colonias maduras visibles sin aumento en medios sólidos. Las micobacterias que forman colonias visibles a simple vista en un plazo de siete días en un subcultivo se conocen como de crecimiento rápido, mientras que las que requieren periodos más largos se denominan de crecimiento lento. ^{[ 3 ]}

Absorción de hierro

La capacidad de absorber hierro de un reactivo inorgánico que contiene hierro ayuda a diferenciar algunas especies de micobacterias. ^{[ 1 ]}

Lebek mediano

Lebek es un medio semisólido que se utiliza para evaluar las preferencias de oxígeno de los aislados de micobacterias. El crecimiento aerófilo se indica por el crecimiento sobre (y por encima de) la superficie de la pared de vidrio del tubo; el crecimiento microaerófilo se indica por el crecimiento por debajo de la superficie. ^{[ 4 ]}

Agar MacConkey sin cristal violeta

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Acumulación de niacina (método de la tira de papel)

La niacina se forma como subproducto metabólico por todas las micobacterias, pero algunas especies poseen una enzima que convierte la niacina libre en ribonucleótido de niacina . M. tuberculosis (y algunas otras especies) carecen de esta enzima y acumulan niacina como subproducto soluble en agua en el medio de cultivo. ^{[ 1 ]}

Reducción de nitratos

Las micobacterias que contienen nitroreductasa catalizan la reducción de nitrato a nitrito . La presencia de nitrito en el medio de ensayo se detecta mediante la adición de sulfanilamida y n-naftiletilendiamina. Si hay nitrato presente, se forma un colorante de diazonio rojo. ^{[ 1 ]}

Fotorreactividad de las micobacterias;

Algunas micobacterias producen pigmentos carotenoides sin luz; otras requieren fotoactivación para la producción de pigmentos. Las fotocromógenas producen colonias no pigmentadas cuando se cultivan en la oscuridad, y colonias pigmentadas después de la exposición a la luz y la reincubación. Las escotocromógenas producen colonias de color amarillo intenso a naranja cuando se cultivan tanto en la luz como en la oscuridad. Las no fotocromógenas no presentan pigmentación ni en la luz ni en la oscuridad, o tienen un pigmento amarillo pálido, beige o marrón claro que no se intensifica después de la exposición a la luz. ^{[ 3 ]}

Tolerancia al picrato

Crece en agar Sauton que contiene ácido pícrico (0,2% p/v) después de tres semanas ^{[ 1 ].}

Pigmentación

Algunas micobacterias producen pigmentos carotenoides sin luz; otras requieren fotoactivación para la producción de pigmentos (véase fotorreactividad, arriba). ^{[ 3 ]}

Sensibilidad a la pirazinamida (PZA)

La desamidación de la pirazinamida a ácido pirazinoico (considerado el componente activo del fármaco pirazinamida ) en cuatro días es una característica fisiológica útil para distinguir a los miembros del complejo M. tuberculosis . ^{[ 1 ]}

tolerancia al cloruro de sodio

Crecimiento en medio LJ que contiene 5% de NaCl ^{[ 1 ]}

Sensibilidad a la hidrazida del ácido tiofeno-2-carboxílico (TCH)

El crecimiento de M. bovis y M. africanum subtipo II es inhibido por la hidrazida del ácido tiofeno-2-carboxílico ; el crecimiento de M. tuberculosis y M. africanum subtipo I no se ve inhibido. ^{[ 1 ]}

Hidrólisis del polisorbato 80

Una prueba para lipasa utilizando polisorbato 80 (monooleato de sorbitán de polioxietileno, un detergente). Ciertas micobacterias poseen una lipasa que lo descompone en ácido oleico y sorbitol polioxietilado . La solución de prueba también contiene rojo fenol , que se estabiliza con el polisorbato 80; cuando este último se hidroliza, el rojo fenol cambia de amarillo a rosa. ^{[ 1 ]}

Ureasa (adaptación a micobacterias)

Con un asa de inoculación, se transfieren varias asas de colonias de prueba de micobacterias a 0,5 mL de sustrato de ureasa  , se mezclan para emulsionar y se incuban a 35 °C durante tres días; se busca un cambio de color (de amarillo ámbar a rojo rosado). ^{[ 1 ]}