Fotoblanqueamiento

En óptica , el fotoblanqueo (a veces denominado desvanecimiento) es la alteración fotoquímica de un colorante o una molécula de fluoróforo de tal manera que se vuelve permanentemente incapaz de fluorescer. Esto es causado por la ruptura de enlaces covalentes o reacciones no específicas entre el fluoróforo y las moléculas circundantes. ^{[ 1 ] [ 2 ]} Estas modificaciones irreversibles en los enlaces covalentes son causadas por la transición de un estado singlete al estado triplete de los fluoróforos. El número de ciclos de excitación para lograr el blanqueamiento completo varía. En microscopía , el fotoblanqueo puede complicar la observación de moléculas fluorescentes, ya que eventualmente serán destruidas por la exposición a la luz necesaria para estimular su fluorescencia. Esto es especialmente problemático en la microscopía de lapso de tiempo .

Sin embargo, también se puede utilizar el fotoblanqueo antes de aplicar las moléculas fluorescentes (principalmente unidas a anticuerpos ), en un intento de suprimir la autofluorescencia . Esto puede ayudar a mejorar la relación señal-ruido .

El fotoblanqueo también puede utilizarse para estudiar el movimiento y/o la difusión de moléculas, por ejemplo, mediante la técnica FRAP , en la que el movimiento de los componentes celulares puede confirmarse observando una recuperación de la fluorescencia en el lugar del fotoblanqueo, o mediante las técnicas FLIP , en las que se realizan múltiples rondas de fotoblanqueo para poder observar la propagación de la pérdida de fluorescencia en la célula.

La pérdida de actividad causada por el fotoblanqueo puede controlarse reduciendo la intensidad o el tiempo de exposición a la luz, aumentando la concentración de fluoróforos, disminuyendo la frecuencia y, por lo tanto, la energía de los fotones de la luz incidente, o empleando fluoróforos más robustos y menos propensos al blanqueamiento (por ejemplo, colorantes de cianina, Alexa Fluors o DyLight Fluors , AttoDyes, Janelia Dyes y otros). En una aproximación razonable, una molécula dada se destruirá después de una exposición constante (intensidad de emisión x tiempo de emisión x número de ciclos) porque, en un entorno constante, cada ciclo de absorción-emisión tiene la misma probabilidad de causar fotoblanqueo.

El fotoblanqueo es un parámetro importante a tener en cuenta en la obtención de imágenes de fluorescencia de molécula única en tiempo real en biofísica . A las intensidades de luz utilizadas en la obtención de imágenes de fluorescencia de molécula única (0,1-1  kW/cm² ^en configuraciones experimentales típicas), incluso los fluoróforos más robustos continúan emitiendo hasta 10 segundos antes de sufrir fotoblanqueo en un solo paso. Para algunos colorantes, la vida útil puede prolongarse entre 10 y 100 veces utilizando sistemas de eliminación de oxígeno (hasta 1000 segundos con la optimización de los parámetros de imagen y la relación señal-ruido). Por ejemplo, una combinación de ácido protocatecuico (PCA) y protocatecuato 3,4-dioxigenasa (PCD) se utiliza a menudo como sistema de eliminación de oxígeno, lo que aumenta la vida útil de la fluorescencia en más de un minuto.

Dependiendo de su composición química específica, las moléculas pueden sufrir fotoblanqueo tras absorber tan solo unos pocos fotones, mientras que las moléculas más resistentes pueden experimentar muchos ciclos de absorción/emisión antes de destruirse:

• Proteína fluorescente verde : 10⁴ ^– 10⁵ ^fotones ; vida útil de 0,1–1,0 segundos.
• Colorante orgánico típico: 10⁵ ^– 10⁶ ^fotones ; vida útil de 1–10 segundos.
• Punto cuántico de CdSe/ZnS : 10⁸ ^fotones ; vida útil > 1000 segundos.

Este uso del término "vida útil" no debe confundirse con la "vida útil" medida mediante imágenes de vida útil de fluorescencia .

• Agotamiento de la capa de ozono

• Introducción a la microscopía óptica: un artículo sobre el fotoblanqueo.
• Viegas MS; Martins TC; Seco F; do Carmo A (2007). "Una metodología mejorada y rentable para la reducción de la autofluorescencia en estudios de inmunofluorescencia directa en tejidos fijados con formalina e incluidos en parafina". Eur J Histochem . 51 (1): 59– 66. PMID 17548270 .