Aequorina

La aequorina es una fotoproteína activada por calcio aislada del hidrozoo Aequorea victoria . ^{[ 1 ]} Su bioluminiscencia fue estudiada décadas antes de que la proteína fuera aislada del animal por Osamu Shimomura en 1962. ^{[ 2 ]} En el animal, la proteína se presenta junto con la proteína fluorescente verde para producir luz verde por transferencia de energía resonante , mientras que la aequorina por sí sola genera luz azul.

Cuando se habla de "ADN de medusa" que puede crear animales "brillantes", a menudo se hace referencia a animales transgénicos que expresan la proteína fluorescente verde, no la aequorina, aunque ambas derivan originalmente del mismo animal.

La apoaequorina, la porción proteica de la aequorina, es un ingrediente del suplemento dietético Prevagen. La Comisión Federal de Comercio de Estados Unidos (FTC) ha acusado al fabricante de publicidad engañosa por sus afirmaciones sobre la mejora de la memoria.

El trabajo sobre la aequorina comenzó con E. Newton Harvey en 1921. ^{[ 3 ]} Aunque Harvey no pudo demostrar una reacción clásica de luciferasa - luciferina , demostró que el agua podía producir luz a partir de fotocitos secos y que la luz podía producirse incluso en ausencia de oxígeno. Posteriormente, Osamu Shimomura comenzó a trabajar en la bioluminiscencia de Aequorea en 1961. Esto implicó la laboriosa recolección de decenas de miles de medusas en los muelles de Friday Harbor, Washington . ^{[ 1 ]} Se determinó que se podía producir luz a partir de extractos con agua de mar y, más específicamente, con calcio . ^{[ 2 ]} También se observó durante la extracción que el animal crea luz verde debido a la presencia de la proteína fluorescente verde , que cambia la luz azul natural de la aequorina a verde. ^{[ 4 ]}

Si bien el enfoque principal de su trabajo fue la bioluminiscencia, ^{[ 5 ]} Shimomura y otros dos, Martin Chalfie y Roger Tsien , fueron galardonados con el Premio Nobel en 2008 por su trabajo sobre proteínas fluorescentes verdes .

La aequorina es una holoproteína compuesta por dos unidades distintas: la apoproteína , denominada apoaequorina , con un peso molecular aproximado de 21 kDa , y el grupo prostético coelenterazina , la luciferina. ^{[ 6 ]} Es decir, la apoaequorina es la enzima producida en los fotocitos del animal, y la coelenterazina es el sustrato cuya oxidación cataliza la enzima. Cuando la coelenterazina se une, se denomina aequorina. Cabe destacar que la proteína contiene tres motivos EF-mano que funcionan como sitios de unión para iones Ca²⁺ ^. [ ^{7 ] La} ​​proteína pertenece a la superfamilia de las proteínas fijadoras de calcio, que cuenta con unas 66 subfamilias. ^{[ 8 ]}

La estructura cristalina reveló que la aequorina se une a la coelenterazina y al oxígeno en forma de peróxido , coelenterazina-2-hidroperóxido. ^{[ 9 ]} El sitio de unión para los dos primeros átomos de calcio muestra una afinidad 20 veces mayor por el calcio que el tercer sitio. ^{[ 10 ]} Sin embargo, afirmaciones anteriores de que solo dos manos EF se unen al calcio ^{[ 11 ]} fueron cuestionadas cuando estructuras posteriores indicaron que los tres sitios pueden unirse al calcio. ^{[ 12 ]} Por lo tanto, los estudios de titulación muestran que los tres sitios de unión al calcio son activos, pero solo se necesitan dos iones para desencadenar la reacción enzimática. ^{[ 13 ]}

Otros estudios han demostrado la presencia de un enlace de cisteína interno que mantiene la estructura de la aequorina. ^{[ 14 ]} Esto también ha explicado la necesidad de un reactivo tiólico como el beta mercaptoetanol en la regeneración de la proteína, ya que dichos reactivos debilitan los enlaces sulfhidrilo entre los residuos de cisteína , acelerando la regeneración de la aequorina.

La caracterización química de la aequorina indica que la proteína es relativamente resistente a tratamientos agresivos. La aequorina es resistente al calor. ^{[ 15 ]} Tras ser mantenida a 95  °C durante 2 minutos, la proteína perdió solo un 25 % de su actividad. Los desnaturalizantes como la urea 6 M o el clorhidrato de guanidina 4 M no destruyeron la proteína.

Se presume que la aequorina está codificada en el genoma de Aequorea . Se recuperaron al menos cuatro copias del gen como ADNc del animal. ^{[ 16 ] [ 17 ]} Dado que el genoma no ha sido secuenciado, no está claro si las variantes de ADNc pueden explicar todas las isoformas de la proteína. ^{[ 18 ]}

Los primeros estudios de la bioluminiscencia de Aequorea realizados por E. Newton Harvey observaron que la bioluminiscencia aparece como un anillo alrededor de la campana y ocurre incluso en ausencia de aire. ^{[ 19 ]} Esto fue notable porque la mayoría de las reacciones de bioluminiscencia requieren oxígeno , y llevó a la idea de que los animales almacenan oxígeno de alguna manera. ^{[ 20 ]} Posteriormente se descubrió que la apoproteína puede unirse de forma estable al coelenterazina-2-hidroperóxido, y el oxígeno es necesario para la regeneración a esta forma activa de aequorina. ^{[ 21 ]} Sin embargo, en presencia de iones de calcio , la proteína sufre un cambio conformacional y convierte su grupo prostético, coelenterazina-2-hidroperóxido, en coelenteramida excitada y CO ₂ . ^{[ 22 ]} A medida que la coelenteramida excitada se relaja al estado fundamental, se emite luz azul ( longitud de onda de 465  nm). Antes de que se intercambie la coelenteramida, toda la proteína sigue siendo fluorescente azul. ^{[ 23 ] [ 24 ]} debido a la conexión entre bioluminiscencia y fluorescencia , esta propiedad fue en última instancia importante en el descubrimiento de la luciferina coelenterazina . ^{[ 25 ]}

Dado que la luz emitida se puede detectar fácilmente con un luminómetro , la aequorina se ha convertido en una herramienta útil en biología molecular para la medición de los niveles intracelulares de Ca2 ⁺ . ^{[ 26 ]} La purificación exitosa temprana de la aequorina condujo a los primeros experimentos que involucraron la inyección de la proteína en los tejidos de animales vivos para visualizar la liberación fisiológica de calcio en las fibras musculares de un percebe. ^{[ 27 ]} Desde entonces, la proteína se ha utilizado ampliamente en muchos sistemas biológicos modelo , incluidos el pez cebra , ^{[ 28 ]} ratas , ratones y células cultivadas . ^{[ 29 ] [ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]}

Las células cultivadas que expresan el gen de la aequorina pueden sintetizar eficazmente la apoaequorina; sin embargo, la expresión recombinante produce únicamente la apoproteína . Por lo tanto, es necesario añadir coelenterazina al medio de cultivo de las células para obtener una proteína funcional y así utilizar su emisión de luz azul para medir la concentración de Ca²⁺ ^. La coelenterazina es una molécula hidrofóbica y, por consiguiente, se absorbe fácilmente a través de las paredes celulares de plantas y hongos , así como de la membrana plasmática de eucariotas superiores, lo que hace que la aequorina sea adecuada como indicador ^de Ca²⁺ en plantas, hongos y células de mamíferos. ^{[ 33 ] [ 34 ]}

La aequorina presenta varias ventajas sobre otros indicadores de Ca²⁺ ^. Debido a su gran tamaño, la proteína tiene una baja tasa de fuga celular en comparación con colorantes lipofílicos como el DiI . Carece de fenómenos de compartimentalización o secuestro intracelular, como suele ocurrir con los colorantes sensibles al voltaje , y no altera las funciones celulares ni el desarrollo embrionario. Además, la luz emitida por la oxidación de la coelenterazina no depende de ninguna excitación óptica, eliminando así los problemas de autofluorescencia. ^{[ 35 ]} La principal limitación de la aequorina es que el grupo prostético coelenterazina se consume irreversiblemente para producir luz, y requiere la adición continua de coelenterazina al medio. Estos problemas impulsaron el desarrollo de otros sensores de calcio codificados genéticamente, como el sensor basado en calmodulina , cameleon , ^{[ 36 ]} desarrollado por Roger Tsien, y el sensor basado en troponina , TN-XXL , desarrollado por Oliver Griesbeck. ^{[ 37 ]}

La apoaequorina es un ingrediente de Prevagen, comercializado por Quincy Bioscience como suplemento para la memoria. En 2017, la Comisión Federal de Comercio de EE. UU. (FTC) acusó al fabricante de publicidad engañosa , afirmando que el producto mejora la memoria, proporciona beneficios cognitivos y que su eficacia está "clínicamente demostrada". ^{[ 38 ] [ 39 ]} Según la FTC, "los responsables de la comercialización de Prevagen se aprovecharon de los temores de los consumidores mayores que experimentan pérdida de memoria relacionada con la edad ". Quincy declaró que impugnaría las acusaciones. ^{[ 40 ] [ 41 ]}

Antes de la demanda, un ensayo clínico realizado por investigadores empleados por Quincy Bioscience "no encontró ningún beneficio general en comparación con un placebo para sus criterios de valoración principales relacionados con la memoria y la cognición", mientras que la publicidad de la empresa citaba engañosamente algunos análisis de subgrupos controvertidos que mostraban leves mejoras. ^{[ 42 ] [ 43 ]}

La demanda ( Spath, et al. v. Quincy Bioscience Holding Company, Inc., et al. , Caso n.° 18-cv-12416, D. NJ.) fue desestimada en el tribunal de distrito, pero se interpuso un recurso para revocar dicha desestimación. La demanda se consolidó con otra contra Quincy Pharmaceuticals, Vanderwerff v. Quincy Bioscience (Caso n.° 17-cv-784, D. NJ), que fue el caso principal. ^{[ 44 ]}

El 21 de febrero de 2019, el Tribunal de Apelaciones del Segundo Circuito de los Estados Unidos dictaminó que la FTC y el estado de Nueva York podían continuar con su demanda contra Quincy Bioscience por sus afirmaciones de que Prevagen puede mejorar la memoria. La orden se produjo menos de dos semanas después de que las partes presentaran sus argumentos ante un panel de tres jueces del circuito, donde los abogados de la compañía admitieron que no "discutían que, si se analizaba a las 211 personas que completaron el estudio, no existía una diferencia estadísticamente significativa". El tribunal desestimó enérgicamente las alegaciones de los abogados de la compañía de que la FTC había emprendido esta acción por motivos políticos. ^{[ 45 ] [ 46 ]}

El 23 de marzo de 2020, un juez magistrado federal del Tribunal de Distrito de los Estados Unidos para el Distrito Sur de Florida emitió un informe y recomendaciones que certificaban una demanda colectiva a nivel nacional para el grupo de consumidores que compraron Prevagen durante los cuatro años anteriores. ^{[ 47 ]} El juicio en el caso se programó para octubre de 2020. ^{[ 47 ] [ 48 ]}

A fecha de 21 de septiembre de 2020 Quincy Bioscience acordó resolver las demandas que alegaban que había presentado sus productos Prevagen de forma engañosa, afirmando que favorecían la salud cerebral y ayudaban con la pérdida de memoria. Según los términos del acuerdo, los compradores elegibles que presentaran su solicitud antes del 26 de octubre de 2020, para compras realizadas entre 2007 y el 31 de julio de 2020, podrían recuperar reembolsos de hasta 70 dólares. ^{[ 49 ]}

La Dra. Harriet Hall , escribiendo para Science-Based Medicine , señaló que el estudio patrocinado por Quincy (conocido como "Estudio de la Memoria de Madison") fue negativo, pero que la compañía utilizó manipulación de datos para encontrar resultados favorables. Escribió que los estudios de seguridad citados eran todos estudios en ratas y que su afirmación de que la apoaequorina atraviesa la barrera hematoencefálica se basaba únicamente en un estudio en perros. ^{[ 50 ] [ 51 ]} La Asociación Estadounidense de Farmacéuticos advierte que es improbable que la apoaequorina "se absorba en un grado significativo; en cambio, se degrada en aminoácidos". ^{[ 52 ]}

El 3 de abril de 2025, Quincy Bioscience, codemandante junto con Amazon, ganó una demanda contra varios vendedores de Prevagen falsificado en el sitio web de Amazon. Un juez federal de Washington otorgó un total combinado de $1,895,375.40 en sentencias por rebeldía. ^{[ 53 ] [ 54 ]}

Se alega que Prevagen es un objetivo de robo en tiendas minoristas por parte de grupos del crimen organizado minorista. Varios factores contribuyen a que sea un objetivo popular, incluyendo su precio, demanda y afirmaciones de marketing sobre su efectividad. El 24 de abril de 2020, el Tribunal de Apelaciones del Séptimo Circuito de los Estados Unidos confirmó un fallo a favor de Quincy que encontró a un vendedor en línea de Prevagen responsable por vender productos Prevagen en condiciones dañadas y productos que el vendedor sabía o debería haber sabido que eran robados, ordenando al vendedor pagar $ 480,968.13 en daños. ^{[ 55 ]}  El 24 de agosto de 2023, el Fiscal General de Florida acusó a dos miembros de una red criminal ^{[ 56 ]} de robar $ 10,000 en Prevagen y otros artículos. El 21 de mayo de 2024, el líder de una red de robo interestatal ^{[ 57 ]} fue sentenciado a prisión federal por dirigir una red criminal que robó mercancía por un valor estimado de 9 millones de dólares, incluyendo Prevagen, Abreva , Zantac y otros productos, durante tres años.

• Entrada de Swiss-Prot Aequorin archivada el 23/03/2007 en Wayback Machine .