purificación de proteínas

Si la proteína de interés no es secretada por el organismo a la solución circundante, el primer paso de cada proceso de purificación es la ruptura de las células que contienen la proteína. Dependiendo de la fragilidad de la proteína y la estabilidad de las células, se podría utilizar, por ejemplo, uno de los siguientes métodos: i) congelación y descongelación repetidas, ii) sonicación , iii) homogeneización a alta presión ( prensa francesa ), iv) homogeneización por molienda (molino de perlas) y v) permeabilización con detergentes (p. ej., Triton X-100 ) y/o enzimas (p. ej., lisozima ). ^{[ 4 ]} Finalmente, los restos celulares se pueden eliminar mediante centrifugación diferencial, un procedimiento en el que el homogeneizado se centrifuga a baja velocidad y luego a mayor fuerza para obtener un precipitado compuesto por núcleos y sobrenadante. Esto produce varias fracciones de densidad decreciente, a una de las cuales se le aplican técnicas de purificación más selectivas. ^{[ 1 ]}

Además, durante la lisis celular se liberan proteasas que comienzan a digerir las proteínas de la solución. Si la proteína de interés es sensible a la proteólisis , se recomienda proceder rápidamente y mantener el extracto refrigerado para ralentizar la digestión. Como alternativa, se pueden añadir uno o más inhibidores de proteasas al tampón de lisis justo antes de la ruptura celular. En ocasiones, también es necesario añadir ADNasa para reducir la viscosidad del lisado celular causada por un alto contenido de ADN .

La centrifugación es un proceso que utiliza la fuerza centrífuga para separar mezclas de partículas de diferentes masas o densidades suspendidas en un líquido. Cuando un recipiente (generalmente un tubo o botella) que contiene una mezcla de proteínas u otra materia particulada, como células bacterianas, gira a alta velocidad, la inercia de cada partícula genera una fuerza en la dirección de su velocidad, proporcional a su masa. La tendencia de una partícula a moverse a través del líquido debido a esta fuerza se ve contrarrestada por la resistencia que el líquido ejerce sobre ella. El efecto neto de hacer girar la muestra en una centrífuga es que las partículas más grandes, pequeñas y densas se desplazan hacia afuera más rápido que las partículas menos grandes o aquellas con mayor resistencia en el líquido. Al centrifugar suspensiones de partículas, puede formarse un sedimento en el fondo del recipiente, enriquecido con las partículas más grandes y con menor resistencia en el líquido.

Las partículas no compactadas permanecen mayoritariamente en el líquido denominado "sobrenadante" y pueden extraerse del recipiente, separándolo así del sedimento. La velocidad de centrifugación se determina mediante la aceleración angular aplicada a la muestra, que generalmente se mide en comparación con la fuerza g . Si las muestras se centrifugan durante el tiempo suficiente, las partículas en el recipiente alcanzarán el equilibrio, donde se acumulan específicamente en un punto donde su densidad de flotación se equilibra con la fuerza centrífuga. Esta centrifugación de "equilibrio" permite una purificación exhaustiva de una partícula determinada.

La centrifugación en gradiente de sacarosa —un gradiente de concentración lineal de azúcar (típicamente sacarosa, glicerol o un medio de gradiente de densidad a base de sílice, como Percoll )— se genera en un tubo de manera que la concentración más alta se encuentre en la parte inferior y la más baja en la superior. Luego, se coloca una muestra de proteína sobre el gradiente y se centrifuga a alta velocidad en una ultracentrífuga . Esto provoca que las macromoléculas pesadas migren hacia el fondo del tubo más rápidamente que el material más ligero. Durante la centrifugación en ausencia de sacarosa, a medida que las partículas se alejan del centro de rotación, experimentan una fuerza centrífuga cada vez mayor (cuanto más lejos se mueven, más rápido se mueven). El problema es que el rango de separación útil dentro del recipiente se limita a una pequeña ventana observable. Centrifugar una muestra el doble de tiempo no significa que la partícula de interés se desplace el doble de lejos; de hecho, se desplazará significativamente más lejos. Sin embargo, cuando las proteínas se mueven a través de un gradiente de sacarosa, se encuentran con un líquido de densidad y viscosidad crecientes. Un gradiente de sacarosa diseñado adecuadamente contrarrestará la creciente fuerza centrífuga, de modo que las partículas se muevan en proporción directa al tiempo que han permanecido en el campo centrífugo. Las muestras separadas mediante estos gradientes se denominan centrifugaciones zonales de velocidad. Tras separar las proteínas/partículas, el gradiente se fracciona y se recoge. En bioquímica, la ultracentrifugación es valiosa para separar biomoléculas y analizar sus propiedades físicas. ^{[ 1 ]}

La mayoría de las proteínas requieren sal para disolverse en agua, un proceso llamado salinización . A medida que aumenta la concentración de sal, las proteínas pueden precipitar, un proceso llamado precipitación salina que implica un cambio en la solubilidad de las proteínas. ^{[ 1 ]} Por ejemplo, en la purificación de proteínas a granel, un primer paso común para aislar proteínas es la precipitación con sulfato de amonio (NH ₄ ) ₂ SO ₄ . ^{[ 7 ]} Esto se realiza agregando cantidades crecientes de sulfato de amonio y recolectando las diferentes fracciones de proteína precipitada. Posteriormente, el sulfato de amonio se puede eliminar mediante diálisis (separación de proteínas de moléculas pequeñas a través de una membrana semipermeable). ^{[ 1 ]} Durante el paso de precipitación con sulfato de amonio, los grupos hidrofóbicos presentes en las proteínas quedan expuestos a la atmósfera, atrayendo a otros grupos hidrofóbicos; el resultado es la formación de un agregado de componentes hidrofóbicos. En este caso, el precipitado de proteína suele ser visible a simple vista . Una ventaja de este método es que se puede realizar de forma económica, incluso con volúmenes muy grandes.

Las primeras proteínas que se purifican son las hidrosolubles. La purificación de proteínas de membrana integrales requiere la ruptura de la membrana celular para aislar una proteína específica de las demás que se encuentran en el mismo compartimento de membrana. En ocasiones, se puede aislar primero una fracción de membrana en particular, como las mitocondrias , antes de purificar una proteína ubicada en la membrana mitocondrial. Se puede utilizar un detergente como el dodecilsulfato de sodio (SDS) para disolver las membranas celulares y mantener las proteínas de membrana en solución durante la purificación; sin embargo, dado que el SDS provoca desnaturalización , se pueden utilizar detergentes más suaves como el Triton X-100 o el CHAPS para conservar la conformación nativa de la proteína durante la purificación completa.

La cromatografía permite separar proteínas en solución o en condiciones desnaturalizantes mediante geles porosos. Esta técnica, conocida como cromatografía de exclusión por tamaño , ofrece una separación más selectiva . Su principio se basa en que las moléculas más pequeñas deben atravesar un mayor volumen en una matriz porosa. Por consiguiente, las proteínas de un determinado tamaño requerirán un volumen variable de eluyente (disolvente) antes de ser recogidas en el otro extremo de la columna de gel. Las moléculas (o proteínas) más grandes recorrerán un menor volumen y eluirán antes que las más pequeñas.

En el contexto de la purificación de proteínas, el eluyente se suele mezclar en diferentes tubos de ensayo. Se desechan todos los tubos que no contienen trazas medibles de la proteína a purificar. La solución restante está compuesta, por lo tanto, por la proteína a purificar y cualquier otra proteína de tamaño similar.

Una sola técnica de cromatografía basada en propiedades moleculares generalmente no es suficiente para obtener una proteína de alta pureza. ^{[ 1 ]} Además del tamaño, la cromatografía de intercambio iónico separa los compuestos según la naturaleza y el grado de su carga iónica. La columna a utilizar se selecciona según su tipo y fuerza de carga. Las resinas de intercambio aniónico tienen carga positiva y se utilizan para retener y separar compuestos con carga negativa (aniones), mientras que las resinas de intercambio catiónico tienen carga negativa y se utilizan para separar moléculas con carga positiva (cationes).

Antes de que comience la separación, se bombea una solución tampón a través de la columna para equilibrar los iones con cargas opuestas. Al inyectar la muestra, las moléculas del soluto se intercambian con los iones de la solución tampón, ya que compiten por los sitios de unión en la resina. El tiempo de retención de cada soluto depende de la fuerza de su carga. Los compuestos con cargas más débiles eluirán primero, seguidos de aquellos con cargas sucesivamente mayores. Debido a la naturaleza del mecanismo de separación, el pH, el tipo de solución tampón, la concentración de la solución tampón y la temperatura desempeñan un papel importante en el control de la separación.

La cromatografía de intercambio iónico es una herramienta muy potente para la purificación de proteínas y se utiliza con frecuencia tanto en separaciones analíticas como preparativas. Resulta especialmente útil para la purificación de proteínas de unión a ácidos nucleicos, donde se requiere la separación de la proteína del ácido nucleico unido para obtener una muestra pura, libre de ácidos nucleicos copurificados del sistema de expresión o de la fuente nativa.

La electroforesis de flujo libre (FFE) es una técnica de electroforesis sin portador que permite la separación preparativa de proteínas en una corriente laminar de tampón mediante un campo eléctrico ortogonal. Al utilizar un gradiente de pH, que puede ser inducido, por ejemplo, por anfolitos , esta técnica permite separar isoformas de proteínas con una resolución de hasta < 0,02 delta-pI.

El medio HIC es anfifílico, con regiones tanto hidrofóbicas como hidrofílicas, lo que permite la separación de proteínas en función de su hidrofobicidad superficial. Las proteínas objetivo y sus agregados tienden a tener propiedades hidrofóbicas diferentes, y su eliminación mediante HIC purifica aún más la proteína de interés. ^{[ 8 ]} Además, el entorno utilizado suele emplear condiciones desnaturalizantes menos agresivas que otras técnicas de cromatografía, lo que ayuda a preservar la proteína de interés en su estado nativo y funcional. En agua pura, las interacciones entre la resina y las regiones hidrofóbicas de la proteína serían muy débiles, pero esta interacción se potencia al aplicar una muestra de proteína a la resina HIC en un tampón de alta fuerza iónica. La fuerza iónica del tampón se reduce posteriormente para eluir las proteínas en orden de hidrofobicidad decreciente. ^{[ 9 ]}

La cromatografía de afinidad es otra técnica de separación potente y altamente selectiva para la proteína de interés, basada en su conformación molecular, que frecuentemente utiliza resinas específicas para cada aplicación. Estas resinas poseen ligandos unidos a su superficie, específicos para los compuestos que se desean separar. Generalmente, estos ligandos funcionan de manera similar a las interacciones anticuerpo-antígeno. Este ajuste tipo "llave y cerradura" entre el ligando y su compuesto objetivo le confiere una alta especificidad, generando con frecuencia un único pico, mientras que el resto de la muestra no se retiene.

Muchas proteínas de membrana son glicoproteínas y pueden purificarse mediante cromatografía de afinidad con lectinas . Las proteínas solubilizadas con detergente se pueden unir a una resina cromatográfica modificada con una lectina unida covalentemente. Las proteínas que no se unen a la lectina se eliminan mediante lavado, y las glicoproteínas unidas específicamente se eluyen añadiendo una alta concentración de un azúcar que compite con las glicoproteínas unidas en el sitio de unión de la lectina. Algunas lectinas tienen una alta afinidad de unión a los oligosacáridos de las glicoproteínas, que son difíciles de competir con los azúcares, por lo que las glicoproteínas unidas deben liberarse desnaturalizando la lectina.

La cromatografía de inmunoafinidad utiliza la unión específica de un anticuerpo -antígeno para purificar selectivamente la proteína diana. El procedimiento consiste en inmovilizar una proteína a un sustrato sólido (por ejemplo, una microesfera porosa o una membrana), que luego se une selectivamente a la proteína diana, mientras que el resto fluye a través de él. La proteína diana se puede eluir modificando el pH o la salinidad . El ligando inmovilizado puede ser un anticuerpo (como la inmunoglobulina G ) o una proteína (como la proteína A ). Dado que este método no requiere la introducción de una etiqueta, puede utilizarse para proteínas de origen natural. ^{[ 10 ]}

La cromatografía líquida de alto rendimiento o cromatografía líquida de alta presión es una forma de cromatografía que aplica alta presión para impulsar los solutos a través de la columna más rápidamente. Esto significa que la difusión es limitada y la resolución es mejorada. La forma más común es la HPLC de "fase inversa", donde el material de la columna es hidrofóbico . Las proteínas se eluyen mediante un gradiente de cantidades crecientes de un solvente orgánico , como el acetonitrilo. Las proteínas eluyen según su hidrofobicidad. Después de la purificación por HPLC, la proteína está en una solución que solo contiene compuestos volátiles y puede liofilizarse fácilmente. ^{[ 11 ]} La purificación por HPLC frecuentemente resulta en la desnaturalización de las proteínas purificadas y, por lo tanto, no es aplicable a proteínas que no se repliegan espontáneamente.

Otra forma de marcar proteínas es mediante la incorporación de un péptido antigénico a la proteína, para luego purificarla en una columna o incubarla con una resina suelta recubierta con un anticuerpo inmovilizado . Este procedimiento se conoce como inmunoprecipitación . La inmunoprecipitación genera una interacción extremadamente específica que generalmente resulta en la unión exclusiva de la proteína deseada. Las proteínas marcadas purificadas pueden separarse fácilmente de las demás proteínas en solución y posteriormente eluirse en una solución limpia.

Cuando las etiquetas ya no son necesarias, una proteasa puede eliminarlas. Esto suele implicar la creación de un sitio de escisión para la proteasa entre la etiqueta y la proteína.

Las etiquetas de autocorte eliminan la necesidad de proteasas para separar la etiqueta de la proteína diana de interés durante el proceso de purificación ( por ejemplo, iCapTag ™). ^{[ 12 ] [ 13 ]} El componente principal de la etiqueta es una inteína, que se escinde simplemente tras un cambio de pH. La proteína diana pura y sin etiqueta se libera entonces en el tampón de elución.

Los métodos emergentes en biología sintética exploran alternativas sin cromatografía aprovechando la separación de fases líquido-líquido para crear orgánulos sintéticos dentro de células bacterianas, como E. coli. Estos enfoques utilizan estructuras de ARN separadas por fases para compartimentalizar proteínas, lo que permite la organización intracelular, la autoclivaje mediante inteínas y la liberación directa de proteínas sin etiquetas, lo que resulta en una mayor eficiencia en los flujos de trabajo de proteínas recombinantes.

Si la solución no contiene ningún otro componente soluble aparte de la proteína en cuestión, esta puede liofilizarse (secarse). Esto se suele hacer después de un análisis por HPLC. Este proceso simplemente elimina todos los componentes volátiles, dejando solo las proteínas.

La ultrafiltración concentra una solución proteica mediante membranas selectivas permeables. La función de la membrana es permitir el paso del agua y las moléculas pequeñas, reteniendo la proteína. La solución se impulsa contra la membrana mediante una bomba mecánica, presión de gas o centrifugación.

La electroforesis en gel es una técnica de laboratorio común que se puede utilizar tanto para la preparación como para el análisis de muestras. Su principio se basa en el movimiento de iones cargados en un campo eléctrico. En la práctica, las proteínas se desnaturalizan en una solución que contiene un detergente ( SDS ). En estas condiciones, las proteínas se despliegan y se recubren con moléculas de detergente cargadas negativamente. En la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE), las proteínas se separan únicamente en función de su tamaño.

En los métodos analíticos, la proteína migra formando bandas según su tamaño. Cada banda se puede detectar mediante tinciones como el azul de Coomassie o la tinción de plata . Los métodos preparativos para purificar grandes cantidades de proteína requieren su extracción del gel electroforético. Esta extracción puede implicar la escisión del gel que contiene una banda o la elución directa de la banda a medida que se desplaza por el extremo del gel.

En el contexto de una estrategia de purificación, la electroforesis en condiciones desnaturalizantes proporciona una resolución mejorada con respecto a la cromatografía de exclusión por tamaño, pero no se adapta tan bien a grandes cantidades de proteínas en una muestra como las columnas de cromatografía posteriores .

Un procedimiento electroforético no desnaturalizante para aislar metaloproteínas bioactivas en mezclas proteicas complejas es la electroforesis en gel de poliacrilamida nativa preparativa (PAGE). La integridad estructural de la proteína aislada debe confirmarse mediante un método independiente. ^{[ 14 ]}