Marcadores de ADN asociados a sitios de restricción

Los marcadores de ADN asociados a sitios de restricción (RAD) son un tipo de marcador genético útil para el mapeo de asociación , el mapeo de QTL , la genética de poblaciones , la genética ecológica y la genética evolutiva. El uso de marcadores RAD para el mapeo genético se conoce comúnmente como mapeo RAD. Un aspecto importante de los marcadores RAD y el mapeo es el proceso de aislamiento de las etiquetas RAD, que son las secuencias de ADN que flanquean inmediatamente cada instancia de un sitio de restricción particular de una enzima de restricción en todo el genoma. ^{[ 1 ]} Una vez aisladas las etiquetas RAD, se pueden utilizar para identificar y genotipificar polimorfismos de secuencias de ADN, principalmente en forma de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) . ^{[ 1 ]} Los polimorfismos que se identifican y genotipifican mediante el aislamiento y análisis de etiquetas RAD se denominan marcadores RAD. Aunque la genotipificación por secuenciación presenta un enfoque similar al método RAD-seq, difieren en algunos aspectos sustanciales. ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]}

El uso de las secuencias de ADN flanqueantes alrededor de cada sitio de restricción es un aspecto importante de las etiquetas RAD. ^{[ 1 ]} La densidad de etiquetas RAD en un genoma depende de la enzima de restricción utilizada durante el proceso de aislamiento. ^{[ 5 ]} Existen otras técnicas de marcadores de sitios de restricción, como RFLP o polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), que utilizan el polimorfismo de longitud de fragmentos causado por diferentes sitios de restricción para la distinción del polimorfismo genético. El uso de las secuencias de ADN flanqueantes en las técnicas de etiquetas RAD se denomina método de representación reducida. ^{[ 2 ]}

El procedimiento inicial para aislar etiquetas RAD implicaba digerir el ADN con una enzima de restricción específica, ligar adaptadores biotinilados a los extremos salientes, cortar aleatoriamente el ADN en fragmentos mucho más pequeños que la distancia promedio entre sitios de restricción y aislar los fragmentos biotinilados usando perlas de estreptavidina . ^{[ 1 ]} Este procedimiento se usó inicialmente para aislar etiquetas RAD para análisis de microarrays . ^{[ 1 ] [ 6 ] [ 7 ]} Más recientemente, el procedimiento de aislamiento de etiquetas RAD se ha modificado para su uso con secuenciación de alto rendimiento en la plataforma Illumina , que tiene el beneficio de tasas de error brutas muy reducidas y alto rendimiento. ^{[ 5 ]} El nuevo procedimiento implica digerir el ADN con una enzima de restricción particular (por ejemplo: SbfI, NsiI,…), ligar el primer adaptador, llamado P1, a los extremos salientes, cortar aleatoriamente el ADN en fragmentos mucho más pequeños que la distancia promedio entre sitios de restricción, preparar los extremos cortados en extremos romos y ligar el segundo adaptador (P2), y usar PCR para amplificar específicamente los fragmentos que contienen ambos adaptadores. Es importante destacar que el primer adaptador contiene un código de barras de secuencia de ADN corto, llamado MID (identificador molecular) que se usa como marcador para identificar diferentes muestras de ADN que se agrupan y secuencian en la misma reacción. ^{[ 5 ] [ 8 ]} El uso de secuenciación de alto rendimiento para analizar etiquetas RAD se puede clasificar como secuenciación de representación reducida, que incluye, entre otras cosas, RADSeq (RAD-Sequencing). ^{[ 2 ]}

Una vez aisladas las etiquetas RAD, se pueden utilizar para identificar y genotipificar polimorfismos de secuencias de ADN, como los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). ^{[ 1 ] [ 5 ]} Estos sitios polimórficos se denominan marcadores RAD. La forma más eficiente de encontrar etiquetas RAD es mediante secuenciación de ADN de alto rendimiento , ^{[ 5 ] [ 8 ]} denominada secuenciación de etiquetas RAD, secuenciación RAD, RAD-Seq o RADSeq.

Antes del desarrollo de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, los marcadores RAD se identificaban mediante la hibridación de etiquetas RAD a microarrays. ^{[ 1 ] [ 6 ] [ 7 ]} Debido a la baja sensibilidad de los microarrays, este método solo puede detectar polimorfismos de secuencia de ADN que alteran los sitios de restricción y provocan la ausencia de etiquetas RAD, o bien polimorfismos de secuencia de ADN sustanciales que impiden la hibridación de las etiquetas RAD. Por lo tanto, la densidad de marcadores genéticos que se puede alcanzar con microarrays es mucho menor que la que se puede lograr con la secuenciación de ADN de alto rendimiento. ^{[ 9 ]}

Los marcadores RAD se implementaron inicialmente mediante microarrays y posteriormente se adaptaron para NGS (secuenciación de próxima generación). ^{[ 9 ]} Fueron desarrollados conjuntamente por los laboratorios de Eric Johnson y William Cresko en la Universidad de Oregón alrededor de 2006. Confirmaron la utilidad de los marcadores RAD al identificar puntos de ruptura de recombinación en D. melanogaster y al detectar QTL en espinosos de tres espinas. ^{[ 1 ]}

En 2012 se propuso un método de etiquetado RAD modificado llamado RADseq de doble digestión (ddRADseq). ^{[ 10 ] [ 11 ]} Al añadir una segunda enzima de restricción, reemplazar el corte aleatorio y un paso de selección de tamaño de ADN estricto, es posible realizar genotipado poblacional de bajo costo. Esta puede ser una herramienta especialmente poderosa para escaneos de genoma completo para selección y diferenciación poblacional o adaptación poblacional. ^{[ 11 ]}

Un estudio de 2016 presentó un método novedoso llamado hibridación RAD (hyRAD), ^{[ 12 ]} donde fragmentos RAD biotinilados , que cubren una fracción aleatoria del genoma, se utilizan como cebos para capturar fragmentos homólogos de bibliotecas de secuenciación genómica de escopeta . Los fragmentos de ADN se generan primero utilizando el protocolo ddRADseq aplicado a muestras frescas, y se utilizan como sondas de captura de hibridación para enriquecer las bibliotecas de escopeta en los fragmentos de interés. Este enfoque simple y rentable permite la secuenciación de loci ortólogos incluso a partir de muestras de ADN altamente degradadas, abriendo nuevas vías de investigación en el campo de la museómica . Otra ventaja del método es que no depende de la presencia del sitio de restricción , lo que mejora la cobertura de loci entre muestras. La técnica se probó primero en muestras de museo y frescas de Oedaleus decorus , una especie de saltamontes paleártico , y luego se implementó en mielero regente , ^{[ 13 ]} artrópodos , ^{[ 14 ]} entre otras especies. Se desarrolló un protocolo de laboratorio para implementar hyRAD en aves. ^{[ 15 ]}

• Genotipado mediante secuenciación