Marca de tiempo del ARN

Una marca de tiempo de ARN es una tecnología que permite inferir la edad de cualquier transcrito de ARN mediante la edición de ARN . ^{[ 1 ]} En esta técnica, el ARN de interés se etiqueta con un motivo reportero rico en adenosina que consta de múltiples sitios de unión MS2. Estos sitios de unión MS2 reclutan un complejo compuesto por ADAR2 (adenosina desaminasa que actúa sobre el dominio catalítico 2 del ARN) y MCP (proteína de la cápside MS2). La unión de la enzima ADAR2 a la marca de tiempo de ARN inicia la conversión gradual de moléculas de adenosina a inosina . Con el tiempo, estas ediciones se acumulan y se leen mediante secuenciación de ARN (RNA-seq). Esta tecnología nos permite obtener información temporal específica del tipo celular asociada con los datos de RNA-seq, que hasta ahora no era accesible. ^{[ 1 ]}

La llegada de la secuenciación de ARN (RNA-seq) en 2009 permitió una visión más profunda de la biología de tipos celulares únicos al permitir a los investigadores examinar la presencia y cantidad de ARN en una muestra en cualquier momento dado. ^{[ 2 ]} La capacidad de analizar el transcriptoma ha revelado información valiosa sobre las diferencias celulares y los cambios transcripcionales entre tipos celulares. Además, RNA-seq ha proporcionado información para examinar el empalme alternativo de genes , la modificación postranscripcional y los genes de fusión , todo lo cual pasaría desapercibido con el análisis del genoma por sí solo. ^{[ 3 ] [ 4 ]} La pieza que falta en el rompecabezas es comprender temporalmente cuándo se expresan los genes en una célula. RNA-seq requiere la destrucción de la célula, por lo que solo revela el transcriptoma en un momento único. ^{[ 1 ]} Comprender los tiempos de expresión y los patrones de transcripción de los genes crearía una comprensión más profunda de las funciones de los genes y cómo la regulación del tiempo de expresión podría estar afectando los procesos celulares y una posible desregulación podría estar contribuyendo al desarrollo de enfermedades.

En los últimos años, se han creado otras tecnologías con el objetivo de determinar la edad de los transcritos de ARN dentro de una célula. Por ejemplo, TimeLapse-seq, ^{[ 5 ]} SLAM-seq ^{[ 6 ]} , así como la medición de la velocidad del ARN, que es el cambio instantáneo en el estado celular a partir de transcritos no empalmados. ^{[ 7 ]} Sin embargo, estos métodos solo pudieron revelar la edad de los transcritos en un punto temporal fijo y no lograron medir la edad de los transcritos a partir de más de un pulso transcripcional. Si bien esta información es importante, la capacidad de capturar los cambios transcripcionales dinámicos dentro de una célula seguía siendo difícil de alcanzar.

Los grupos de investigación de Edward Boyden en el MIT y Fei Chen en Harvard , ambos en Cambridge, Massachusetts, EE. UU., desarrollaron marcas de tiempo de ARN, un nuevo método (2020) que permite inferir la edad de los transcritos seleccionados en una célula. ^{[ 1 ]} Esta tecnología proporciona los medios para comprender la biología celular a un nuevo nivel y profundizar nuestra comprensión de los procesos celulares y la regulación transcripcional. Además, el uso de marcas de tiempo de ARN no requiere la lisis de la célula, lo cual es una ventaja innegable. Esto permite que las marcas de tiempo tengan la disponibilidad única de sugerir información de múltiples pulsos transcripcionales a lo largo del desarrollo celular en lugar de estar limitadas a un punto de tiempo fijo. ^{[ 1 ]}

1. Una marca de tiempo de ARN es un motivo repetitivo de ARN reportero que sufre gradualmente ediciones de adenosina a inosina (A a I). ​​Las marcas de tiempo de ARN están diseñadas específicamente para ser matrices de secuencias ricas en adenosina con sitios de unión MS2, que son bucles de tallo en la región de edición de las marcas de tiempo. ^{[ 8 ] [ 9 ] [ 10 ]} Una marca de tiempo de ARN puede etiquetarse a un ARN de interés, de modo que se generarán nuevas marcas de tiempo de ARN con pulsos transcripcionales del gen de interés. ^{[ 1 ]}

   

2. ADAR es una enzima importante en esta tecnología, ya que edita la adenosina a inosina (A a I). ​​Las marcas de tiempo de ARN utilizan una versión modificada genéticamente de esta enzima: ADAR2cd (adenosina desaminasa humana que actúa sobre el dominio catalítico del ARN 2). La enzima ADAR2cd está diseñada para unirse específicamente a los sitios MS2, mediante la fusión con la proteína de la cápside MS2 (MCP). ^{[ 11 ]} De esta forma, ADAR2cd se une al ARN marcado y provoca ediciones de A a I que se acumulan con el tiempo. La adenosina es el principal sustrato de ADAR, por lo que las secuencias ricas en adenosina que flanquean los sitios de unión de MS2 proporcionan un excelente mecanismo para facilitar las ediciones de A a I. ^{[ 1 ]}
3. A partir de aquí, se puede utilizar la secuenciación de alto rendimiento para recopilar la información de las marcas de tiempo del ARN. La secuenciación revelará los cambios de A a I como mutaciones de adenosina a guanina, ya que la inosina no es convencional en el ARN. Esto permite incorporar información temporal sobre el ARN de interés en los experimentos de secuenciación de ARN. ^{[ 1 ]}
4. Algorítmicamente, la edad del ARN con marca de tiempo se puede inferir estimando el número total de ediciones de adenosina a inosina en los transcritos de ARNm. Esto permite inferir la edad del transcrito con una precisión de escala horaria. ^{[ 1 ]}

Dado que un promotor específico produce múltiples transcripciones de ARN con marcas de tiempo en las células, se desarrolló un programa transcripcional que utiliza un algoritmo de descenso de gradiente para describir la cantidad de marcas de tiempo generadas en función del tiempo. ^{[ 1 ]} Esto ayuda a determinar el origen del punto temporal de las marcas de tiempo del ARN, y la precisión del algoritmo aumenta con la cantidad de ARN. Además, esto revela el momento en que el promotor específico estuvo activo. ^{[ 1 ]}

Los experimentos de marca de tiempo de ARN se validaron experimentalmente por primera vez en células HEK293T que expresaban la variante ADAR junto con ARN con marca de tiempo bajo el control del elemento de respuesta a la tetraciclina (TRE) inducido por doxiciclina . A partir de estos experimentos, se demostró que la edad de múltiples transcritos de ARN se puede determinar con precisión (con un intervalo de confianza del 95 % de 2,7 ± 0,4 h). ^{[ 1 ]}

A pesar de las numerosas ventajas de este método, existen algunas limitaciones en el marcado temporal del ARN que conviene mencionar:

1. Solo los ARN que están etiquetados con marcas de tiempo pueden leerse mediante esta técnica ^{[ 1 ].}
2. La técnica de marcado temporal produciría resultados diferentes con ARN que tienen vidas medias variables. ^{[ 1 ]} Los investigadores esperan crear un mecanismo en el que sea posible una edición más rápida: esto sería beneficioso para el ARN con vidas medias más cortas y mejoraría la resolución a un punto temporal más preciso que las horas ^{[ 13 ]}
3. Se requiere ingeniería genética para marcar el promotor de interés ^{[ 13 ].}
4. Los investigadores no están seguros de si la calibración en un sistema, por ejemplo el cultivo celular, podría utilizarse para decodificar información obtenida de otros sistemas, como in vivo . ^{[ 1 ]}
5. En procesos transcripcionales más complejos y lentos, el algoritmo de programación transcripcional necesitaría miles de ARN con marcas de tiempo para decodificar los puntos temporales originales. Esto podría resultar laborioso y costoso. ^{[ 1 ]}