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ADN recombinante

Construcción de ADN recombinante, en la que se inserta un fragmento de ADN extraño en un vector plasmídico. En este ejemplo, el gen indicado en blanco se inactiva tras la inserc...

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Construcción de ADN recombinante, en la que se inserta un fragmento de ADN extraño en un vector plasmídico. En este ejemplo, el gen indicado en blanco se inactiva tras la inserción del fragmento de ADN extraño.

Las moléculas de ADN recombinante ( ADNr ) son moléculas de ADN formadas mediante métodos de recombinación genética en laboratorio (como la clonación molecular ) que combinan material genético de múltiples fuentes, creando secuencias que de otro modo no se encontrarían en el genoma .

El ADN recombinante es el nombre general que se le da a un fragmento de ADN creado mediante la combinación de dos o más fragmentos de diferentes fuentes. El ADN recombinante es posible porque las moléculas de ADN de todos los organismos comparten la misma estructura química, diferenciándose únicamente en la secuencia de nucleótidos . A las moléculas de ADN recombinante a veces se las denomina ADN quimérico porque pueden estar formadas por material de dos especies diferentes, como la quimera mítica . La tecnología del ADN recombinante utiliza secuencias palindrómicas y da lugar a la producción de extremos cohesivos y romos .

Las secuencias de ADN utilizadas en la construcción de moléculas de ADN recombinante pueden provenir de cualquier especie . Por ejemplo, el ADN vegetal puede unirse al ADN bacteriano, o el ADN humano al ADN fúngico. Además, mediante la síntesis química de ADN, se pueden crear secuencias de ADN que no existen en la naturaleza e incorporarlas a moléculas de ADN recombinante. Utilizando la tecnología de ADN recombinante y el ADN sintético, se puede crear cualquier secuencia de ADN e introducirla en organismos vivos.

Las proteínas que pueden resultar de la expresión de ADN recombinante dentro de células vivas se denominan proteínas recombinantes . Cuando se introduce ADN recombinante que codifica una proteína en un organismo huésped, la proteína recombinante no necesariamente se produce. [ 1 ] La expresión de proteínas extrañas requiere el uso de vectores de expresión especializados y a menudo requiere una reestructuración significativa por parte de secuencias codificantes extrañas. [ 2 ]

El ADN recombinante se diferencia de la recombinación genética en que el primero es el resultado de métodos artificiales, mientras que el segundo es un proceso biológico normal que da lugar a la remezcla de secuencias de ADN existentes en prácticamente todos los organismos.

Producción

Proceso de clonación de genes

La clonación molecular es el proceso de laboratorio utilizado para producir ADN recombinante. [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ] [ 6 ] Es uno de los dos métodos más utilizados, junto con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), para dirigir la replicación de cualquier secuencia de ADN específica elegida por el experimentador. Existen dos diferencias fundamentales entre ambos métodos. Una es que la clonación molecular implica la replicación del ADN dentro de una célula viva, mientras que la PCR replica el ADN en un tubo de ensayo, libre de células vivas. La otra diferencia es que la clonación implica cortar y pegar secuencias de ADN, mientras que la PCR amplifica copiando una secuencia existente. [ 7 ]

La formación de ADN recombinante requiere un vector de clonación , una molécula de ADN que se replica dentro de una célula viva. Los vectores generalmente se derivan de plásmidos o virus y representan segmentos relativamente pequeños de ADN que contienen las señales genéticas necesarias para la replicación, así como elementos adicionales para facilitar la inserción de ADN extraño, la identificación de células que contienen ADN recombinante y, cuando corresponda, la expresión de dicho ADN. La elección del vector para la clonación molecular depende del organismo huésped, del tamaño del ADN que se va a clonar y de si se va a expresar el ADN extraño y cómo. [ 8 ] Los segmentos de ADN se pueden combinar mediante diversos métodos, como la clonación con enzimas de restricción/ligasas o el ensamblaje de Gibson . [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]

En los protocolos de clonación estándar, la clonación de cualquier fragmento de ADN implica esencialmente siete pasos: (1) Elección del organismo huésped y del vector de clonación, (2) Preparación del ADN del vector, (3) Preparación del ADN que se va a clonar, (4) Creación del ADN recombinante, (5) Introducción del ADN recombinante en el organismo huésped, (6) Selección de organismos que contienen ADN recombinante y (7) Cribado de clones con los insertos de ADN y las propiedades biológicas deseadas. [ 6 ]

expresión del ADN

La expresión del ADN requiere la transfección de células huésped adecuadas. Por lo general, se utilizan células bacterianas, de levadura, de insecto o de mamífero (como células de riñón embrionario humano o células de ovario de hámster chino ) como células huésped. [ 12 ]

Tras el trasplante al organismo huésped, el ADN extraño contenido en el constructo de ADN recombinante puede o no expresarse . Es decir, el ADN puede simplemente replicarse sin expresión, o puede transcribirse y traducirse , produciendo una proteína recombinante. En general, la expresión de un gen extraño requiere la reestructuración del gen para incluir secuencias necesarias para producir una molécula de ARNm que pueda ser utilizada por el aparato de traducción del huésped (por ejemplo, promotor , señal de inicio de la traducción y terminador de la transcripción ). [ 13 ] Se pueden realizar cambios específicos en el organismo huésped para mejorar la expresión del gen ectópico. Además, también pueden ser necesarios cambios en las secuencias codificantes para optimizar la traducción, hacer soluble la proteína, dirigir la proteína recombinante a la ubicación celular o extracelular adecuada y estabilizar la proteína frente a la degradación. [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]

Propiedades de los organismos que contienen ADN recombinante

En la mayoría de los casos, los organismos que contienen ADN recombinante presentan fenotipos aparentemente normales . Es decir, su apariencia, comportamiento y metabolismo suelen permanecer inalterados, y la única forma de demostrar la presencia de secuencias recombinantes es examinar el ADN en sí, generalmente mediante una prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [ 17 ] Existen excepciones importantes, que se describen a continuación.

Si las secuencias de ADNr codifican un gen que se expresa, entonces se puede detectar la presencia de productos de ARN y/o proteínas del gen recombinante, generalmente utilizando métodos de RT-PCR o hibridación Western . [ 17 ] Los cambios fenotípicos macroscópicos no son la norma, a menos que el gen recombinante haya sido seleccionado y modificado para generar actividad biológica en el organismo huésped. [ 18 ] Otros fenotipos que se encuentran incluyen toxicidad para el organismo huésped inducida por el producto del gen recombinante, especialmente si se sobreexpresa o se expresa dentro de células o tejidos inapropiados.

En algunos casos, el ADN recombinante puede tener efectos nocivos incluso si no se expresa. Un mecanismo por el cual esto sucede es la inactivación por inserción , en la cual el ADNr se inserta en un gen de la célula huésped. En algunos casos, los investigadores utilizan este fenómeno para " eliminar " genes y determinar su función e importancia biológica. [ 19 ] Otro mecanismo por el cual la inserción de ADNr en el ADN cromosómico puede afectar la expresión génica es mediante la activación inapropiada de genes de la célula huésped previamente no expresados. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando un fragmento de ADN recombinante que contiene un promotor activo se ubica junto a un gen de la célula huésped previamente silenciado, o cuando un gen de la célula huésped que funciona para restringir la expresión génica sufre inactivación por inserción debido al ADN recombinante.

Aplicaciones del ADN recombinante

El ADN recombinante se utiliza ampliamente en biotecnología , medicina e investigación. Hoy en día, las proteínas recombinantes y otros productos derivados de la tecnología del ADN se encuentran prácticamente en todas las farmacias, consultorios médicos y veterinarios, laboratorios de análisis clínicos y laboratorios de investigación biológica. Además, los organismos modificados mediante tecnología de ADN recombinante, así como los productos derivados de estos organismos, se encuentran en muchas granjas, supermercados , botiquines domésticos e incluso tiendas de mascotas, como las que venden GloFish y otros animales genéticamente modificados .

La aplicación más común del ADN recombinante se encuentra en la investigación básica, donde esta tecnología es fundamental para la mayoría de los trabajos actuales en las ciencias biológicas y biomédicas. [ 17 ] El ADN recombinante se utiliza para identificar, mapear y secuenciar genes, y para determinar su función. Las sondas de ADNr se emplean para analizar la expresión génica dentro de células individuales y en los tejidos de organismos completos. Las proteínas recombinantes se utilizan ampliamente como reactivos en experimentos de laboratorio y para generar sondas de anticuerpos para examinar la síntesis de proteínas dentro de células y organismos. [ 4 ]

Se encuentran muchas aplicaciones prácticas adicionales del ADN recombinante en la industria, la producción de alimentos, la medicina humana y veterinaria, la agricultura y la bioingeniería. [ 4 ] A continuación se identifican algunos ejemplos específicos.

quimosina recombinante

Presente en el cuajo , la quimosina es la enzima responsable de la hidrólisis de la κ - caseína para producir para- κ -caseína y glicomacropéptido , que es el primer paso en la formación del queso y, posteriormente, de la cuajada y el suero . [ 20 ] Fue el primer aditivo alimentario modificado genéticamente utilizado comercialmente. Tradicionalmente, los procesadores obtenían la quimosina del cuajo, una preparación derivada del cuarto estómago de terneros alimentados con leche. Los científicos modificaron genéticamente una cepa no patógena (K-12) de la bacteria E. coli para la producción a gran escala de la enzima en laboratorio. Esta enzima recombinante producida microbiológicamente, estructuralmente idéntica a la enzima derivada del ternero, cuesta menos y se produce en grandes cantidades. Hoy en día, alrededor del 60 % del queso duro estadounidense se elabora con quimosina modificada genéticamente. En 1990, la FDA otorgó a la quimosina la clasificación de " generalmente reconocida como segura " (GRAS, por sus siglas en inglés) basándose en datos que demostraban la seguridad de la enzima. [ 21 ]

insulina humana recombinante

La insulina humana recombinante ha reemplazado casi por completo a la insulina obtenida de fuentes animales (por ejemplo, cerdos y vacas) para el tratamiento de la diabetes tipo 1. Se utilizan ampliamente diversas preparaciones de insulina recombinante. [ 22 ] La insulina recombinante ( insulina aspart ) se sintetiza insertando el gen de la insulina humana en E. coli o levadura ( Saccharomyces cerevisiae ), que luego produce insulina para uso humano. [ 23 ] La insulina producida por E. coli requiere modificaciones postraduccionales adicionales (por ejemplo, glicosilación), mientras que las levaduras pueden realizar estas modificaciones por sí mismas debido a que son organismos huéspedes más complejos. La ventaja de la insulina humana recombinante es que, tras su uso crónico, los pacientes no desarrollan una defensa inmunitaria contra ella, a diferencia de lo que ocurre con la insulina de origen animal, que estimula el sistema inmunitario humano. [ 24 ]

Hormona de crecimiento humana recombinante (HGH, somatotropina)

La hormona del crecimiento humana se administra a pacientes cuyas glándulas pituitarias generan cantidades insuficientes para un crecimiento y desarrollo normales. Antes de que la HGH recombinante estuviera disponible, la HGH para uso terapéutico se obtenía de glándulas pituitarias de cadáveres. Esta práctica insegura provocó que algunos pacientes desarrollaran la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob . La HGH recombinante eliminó este problema y ahora se utiliza con fines terapéuticos. [ 25 ] También se ha utilizado indebidamente como sustancia dopante por atletas y otras personas. [ 26 ] [ 27 ]

Factor VIII de coagulación sanguínea recombinante

El factor VIII es una proteína de coagulación sanguínea que se administra a pacientes con hemofilia , un trastorno hemorrágico que no puede producirlo en cantidades suficientes para mantener una coagulación sanguínea normal. [ 28 ] Antes del desarrollo del factor VIII recombinante, la proteína se obtenía procesando grandes cantidades de sangre humana de múltiples donantes, lo que conllevaba un riesgo muy alto de transmisión de enfermedades infecciosas transmitidas por la sangre , como el VIH y la hepatitis B.

Vacuna recombinante contra la hepatitis B

La infección por hepatitis B puede controlarse eficazmente mediante el uso de una vacuna recombinante de subunidades contra la hepatitis B , que contiene una forma del antígeno de superficie del virus de la hepatitis B producida en células de levadura. El desarrollo de esta vacuna recombinante de subunidades fue un avance importante y necesario, ya que el virus de la hepatitis B, a diferencia de otros virus comunes como el virus de la polio , no puede cultivarse in vitro . [ 29 ]

Anticuerpos recombinantes

Los anticuerpos recombinantes (rAbs) se producen in vitro mediante sistemas de expresión basados ​​en células de mamíferos. Su unión monoespecífica a un epítopo específico hace que los rAbs sean adecuados no solo para fines de investigación, sino también como opciones terapéuticas contra ciertos tipos de cáncer, infecciones y enfermedades autoinmunes. [ 30 ]

Diagnóstico de la infección por VIH

Cada uno de los tres métodos más utilizados para diagnosticar la infección por VIH se ha desarrollado mediante ADN recombinante. La prueba de anticuerpos ( ELISA o Western blot ) utiliza una proteína recombinante del VIH para detectar la presencia de anticuerpos producidos por el organismo en respuesta a la infección. La prueba de ADN busca la presencia de material genético del VIH mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR). El desarrollo de la prueba RT-PCR fue posible gracias a la clonación molecular y el análisis de secuencias de genomas del VIH. ( Página de pruebas de VIH de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. [CDC])

arroz dorado

El arroz dorado es una variedad recombinante de arroz que ha sido modificada genéticamente para expresar las enzimas responsables de la biosíntesis del β-caroteno . [ 18 ] Esta variedad de arroz ofrece grandes posibilidades para reducir la incidencia de la deficiencia de vitamina A en la población mundial. [ 31 ] El arroz dorado no se utiliza actualmente, a la espera de la resolución de cuestiones regulatorias y de propiedad intelectual. [ 32 ] Filipinas aprobó el arroz dorado para consumo humano, animal y para su propagación comercial, pero su producción se ha detenido. El cultivo se interrumpió tras una decisión del Tribunal de Apelaciones de 2024 que revocó su permiso de bioseguridad. [ 33 ]

Cultivos resistentes a los herbicidas

Se han desarrollado variedades comerciales de cultivos agrícolas importantes (como la soja, el maíz, el sorgo, la canola, la alfalfa y el algodón) que incorporan un gen recombinante que produce resistencia al herbicida glifosato (nombre comercial Roundup ) y simplifica el control de malezas mediante la aplicación de glifosato. [ 34 ] Estos cultivos se utilizan comercialmente de forma común en varios países.

Cultivos resistentes a los insectos

Bacillus thuringiensis es una bacteria que produce de forma natural una proteína ( toxina Bt ) con propiedades insecticidas. [ 31 ] Esta bacteria se ha utilizado en cultivos como estrategia de control de insectos durante muchos años, y esta práctica se ha generalizado en la agricultura y la jardinería. Recientemente, se han desarrollado plantas que expresan una forma recombinante de la proteína bacteriana, la cual puede controlar eficazmente a algunos insectos depredadores. Los problemas ambientales asociados con el uso de estos cultivos transgénicos aún no se han resuelto por completo. [ 35 ]

Historia

La idea del ADN recombinante fue propuesta por primera vez por Peter Lobban, un estudiante de posgrado del Prof. Dale Kaiser en el Departamento de Bioquímica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford. [ 36 ] Las primeras publicaciones que describían la producción exitosa y la replicación intracelular del ADN recombinante aparecieron en 1972 y 1973, de Stanford y UCSF . [ 37 ] [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ] En 1980, Paul Berg , profesor del Departamento de Bioquímica de Stanford y autor de uno de los primeros artículos [ 37 ], recibió el Premio Nobel de Química por su trabajo sobre ácidos nucleicos "con especial atención al ADN recombinante". Werner Arber , Hamilton Smith y Daniel Nathans compartieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1978 por el descubrimiento de las endonucleasas de restricción , que mejoraron las técnicas de la tecnología del ADN recombinante.

La Universidad de Stanford solicitó una patente estadounidense sobre ADN recombinante el 4 de noviembre de 1974, nombrando como inventores a Herbert W. Boyer (profesor de la Universidad de California, San Francisco ) y Stanley N. Cohen (profesor de la Universidad de Stanford ); esta patente, US 4,237,224A, fue otorgada el 2 de diciembre de 1980. [ 41 ] [ 42 ] El primer fármaco con licencia generado mediante tecnología de ADN recombinante fue la insulina humana, desarrollada por Genentech y licenciada por Eli Lilly and Company . [ 43 ]

Controversia

Los científicos que participaron en el desarrollo inicial de los métodos de ADN recombinante reconocieron la posibilidad de que los organismos que contenían ADN recombinante presentaran propiedades indeseables o peligrosas. En la Conferencia de Asilomar sobre ADN Recombinante de 1975 , se abordaron estas preocupaciones y se inició una moratoria voluntaria sobre la investigación con ADN recombinante para los experimentos considerados particularmente riesgosos. Esta moratoria se respetó ampliamente hasta que los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU . desarrollaron y publicaron directrices formales para el trabajo con ADN recombinante. Actualmente, las moléculas de ADN recombinante y las proteínas recombinantes no suelen considerarse peligrosas. Sin embargo, persisten las preocupaciones sobre algunos organismos que expresan ADN recombinante, especialmente cuando salen del laboratorio y se introducen en el medio ambiente o la cadena alimentaria. Estas preocupaciones se analizan en los artículos sobre organismos genéticamente modificados y controversias relacionadas con alimentos genéticamente modificados . Además, existen preocupaciones sobre los subproductos en la producción biofarmacéutica, donde el ADN recombinante da lugar a productos proteicos específicos. El principal subproducto, denominado proteína de la célula huésped , proviene del sistema de expresión del huésped y representa una amenaza para la salud del paciente y el medio ambiente en general. [ 44 ] [ 45 ]

Véase también

Referencias

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  42. ↑ Hughes, S. (2001). "Ganar dinero con el ADN. La primera patente importante en biotecnología y la comercialización de la biología molecular, 1974-1980". Isis; una revista internacional dedicada a la historia de la ciencia y sus influencias culturales . 92 (3): 541– 575. doi : 10.1086/385281 . hdl : 10161/8125 . PMID 11810894 . 
  43. ↑ Johnson, IS (1983). "Insulina humana a partir de tecnología de ADN recombinante". Science . 219 (4585): 632– 637. Bibcode : 1983Sci...219..632J . doi : 10.1126/science.6337396 . PMID 6337396 . 
  44. ↑ Wang, Xing; Hunter, Alan K.; Mozier, Ned M. (15 de junio de 2009). "Proteínas de células huésped en el desarrollo de productos biológicos: identificación, cuantificación y evaluación de riesgos" . Biotechnology and Bioengineering . 103 (3): 446– 458. Bibcode : 2009BiotB.103..446W . doi : 10.1002/bit.22304 . PMID 19388135 . 
  45. ↑ Bracewell, Daniel G.; Francis, Richard; Smales, C. Mark (septiembre de 2015). "El futuro de la identificación de proteínas de células huésped (HCP) durante el desarrollo y la fabricación de procesos vinculados a una gestión basada en riesgos para su control" . Biotechnology and Bioengineering . 112 (9): 1727– 1737. Bibcode : 2015BiotB.112.1727B . doi : 10.1002/bit.25628 . PMC 4973824. PMID 25998019 .  

Lecturas adicionales

  • El octavo día de la creación: Los artífices de la revolución en biología . Touchstone Books, ISBN 0-671-22540-52.ª edición: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996, edición de bolsillo: ISBN 0-87969-478-5.
  • Micklas, David. 2003. Ciencia del ADN: Un primer curso . Cold Spring Harbor Press: ISBN 978-0-87969-636-8.
  • Rasmussen, Nicolas , Gene Jockeys: Life Science and the rise of Biotech Enterprise , Johns Hopkins University Press, (Baltimore), 2014. ISBN 978-1-42141-340-2.
  • Rosenfeld, Israel. 2010. ADN: Una guía gráfica de la molécula que conmocionó al mundo . Columbia University Press: ISBN 978-0-231-14271-7.
  • Schultz, Mark y Zander Cannon. 2009. La materia de la vida: una guía gráfica de genética y ADN . Hill and Wang: ISBN 0-8090-8947-5.
  • Watson, James. 2004. ADN: El secreto de la vida . Random House: ISBN 978-0-09-945184-6.
  • Ficha informativa sobre ADN recombinante (de la Universidad de New Hampshire)
  • Plásmidos en levaduras (Ficha informativa de la Universidad Estatal de San Diego)
  • Investigación sobre ADN recombinante en la UCSF y su aplicación comercial en Genentech. Transcripción editada de una entrevista de 1994 con Herbert W. Boyer, proyecto de historia viva. Historia oral.
  • Manual de principios y métodos para la purificación de proteínas recombinantes. Archivado el 5 de diciembre de 2008 en Wayback Machine.
  • Instituto Tecnológico de Massachusetts, Programa de Historia Oral, Colección de Historia Oral sobre la Controversia del ADN Recombinante , MC-0100. Instituto Tecnológico de Massachusetts, Departamento de Colecciones Distintivas, Cambridge, Massachusetts.