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Enzima de restricción

Una enzima de restricción , endonucleasa de restricción , REasa , ENasa o restrictasa es una enzima que corta el ADN en fragmentos en o cerca de sitios de reconocimiento específ...

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Una enzima de restricción , endonucleasa de restricción , REasa , ENasa o restrictasa es una enzima que corta el ADN en fragmentos en o cerca de sitios de reconocimiento específicos dentro de las moléculas conocidos como sitios de restricción . [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] Las enzimas de restricción son una clase del grupo más amplio de enzimas endonucleasas . Las enzimas de restricción se clasifican comúnmente en cinco tipos, que difieren en su estructura y en si cortan su sustrato de ADN en su sitio de reconocimiento, o si los sitios de reconocimiento y corte están separados entre sí. Para cortar el ADN, todas las enzimas de restricción hacen dos incisiones, una a través de cada esqueleto de azúcar-fosfato (es decir, cada hebra) de la doble hélice del ADN .

Estas enzimas se encuentran en bacterias y arqueas y proporcionan un mecanismo de defensa contra los virus invasores . [ 4 ] [ 5 ] Dentro de un procariota , las enzimas de restricción cortan selectivamente el ADN extraño en un proceso llamado digestión por restricción ; mientras tanto, el ADN del huésped está protegido por una enzima modificadora (una metiltransferasa ) que modifica el ADN procariota y bloquea la escisión. Juntos, estos dos procesos forman el sistema de restricción-modificación . [ 6 ]

Se conocen más de 3600 endonucleasas de restricción que representan más de 250 especificidades diferentes. [ 7 ] Más de 3000 de ellas se han estudiado en detalle y más de 800 están disponibles comercialmente. [ 8 ] Estas enzimas se utilizan habitualmente para la modificación del ADN en laboratorios y son una herramienta vital en la clonación molecular . [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]

Historia

Las diferentes enzimas de restricción que actúan sobre diferentes sitios de reconocimiento producen diferentes fragmentos de ADN.

El término enzima de restricción se originó a partir de los estudios del fago λ , un virus que infecta bacterias , y el fenómeno de restricción y modificación controlada por el huésped de dicho fago bacteriano o bacteriófago . [ 12 ] El fenómeno se identificó por primera vez en trabajos realizados en los laboratorios de Salvador Luria , Jean Weigle y Giuseppe Bertani a principios de la década de 1950. [ 13 ] [ 14 ] Se descubrió que, para un bacteriófago λ que puede crecer bien en una cepa de Escherichia coli , por ejemplo E. coli C, cuando crece en otra cepa, por ejemplo E. coli K, sus rendimientos pueden disminuir significativamente, hasta en tres a cinco órdenes de magnitud. La célula huésped, en este ejemplo E. coli K, se conoce como huésped restrictivo y parece tener la capacidad de reducir la actividad biológica del fago λ. Si un fago se establece en una cepa, la capacidad de ese fago para crecer también se restringe en otras cepas. En la década de 1960, se demostró en trabajos realizados en los laboratorios de Werner Arber y Matthew Meselson que la restricción es causada por una escisión enzimática del ADN del fago, y la enzima involucrada fue denominada, por lo tanto, enzima de restricción. [ 4 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]

Las enzimas de restricción estudiadas por Arber y Meselson eran enzimas de restricción de tipo I, que cortan el ADN aleatoriamente lejos del sitio de reconocimiento . [ 7 ] En 1970, Hamilton O. Smith , Thomas Kelly y Kent Wilcox aislaron y caracterizaron la primera enzima de restricción de tipo II , HindII, de la bacteria Haemophilus influenzae . [ 18 ] [ 19 ] Las enzimas de restricción de este tipo son más útiles para el trabajo de laboratorio ya que cortan el ADN en el sitio de su secuencia de reconocimiento y son las más utilizadas como herramienta de biología molecular . [ 20 ] Más tarde, Daniel Nathans y Kathleen Danna demostraron que la escisión del ADN del virus simio 40 (SV40) por enzimas de restricción produce fragmentos específicos que pueden separarse utilizando electroforesis en gel de poliacrilamida , demostrando así que las enzimas de restricción también pueden utilizarse para mapear ADN. [ 21 ] Por su trabajo en el descubrimiento y caracterización de enzimas de restricción, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1978 fue otorgado a Werner Arber , Daniel Nathans y Hamilton O. Smith . [ 22 ] El descubrimiento de las enzimas de restricción permite manipular el ADN, lo que lleva al desarrollo de la tecnología del ADN recombinante que tiene muchas aplicaciones, por ejemplo, permite la producción a gran escala de proteínas como la insulina humana utilizada por pacientes diabéticos . [ 13 ] [ 23 ]

Orígenes

Es probable que las enzimas de restricción evolucionaran a partir de un ancestro común y se generalizaran mediante transferencia horizontal de genes . [ 24 ] [ 25 ] Además, existe evidencia creciente de que las endonucleasas de restricción evolucionaron como un elemento genético egoísta . [ 26 ]

Sitio de reconocimiento

Un sitio de reconocimiento palindrómico se lee igual en la hebra inversa que en la hebra directa cuando ambas se leen en la misma orientación.

Las enzimas de restricción reconocen una secuencia específica de nucleótidos [ 2 ] y producen un corte de doble cadena en el ADN. Las secuencias de reconocimiento también se pueden clasificar por el número de bases en su sitio de reconocimiento, generalmente entre 4 y 8 bases, y el número de bases en la secuencia determinará con qué frecuencia aparecerá el sitio por casualidad en cualquier genoma dado, por ejemplo, una secuencia de 4 pares de bases ocurriría teóricamente una vez cada 4^4 o 256 pb, 6 bases, 4^6 o 4096 pb, y 8 bases serían 4^8 o 65 536 pb. [ 27 ] Muchas de ellas son palindrómicas , lo que significa que la secuencia de bases se lee igual de adelante hacia atrás que de atrás hacia adelante. [ 28 ] En teoría, hay dos tipos de secuencias palindrómicas que pueden ser posibles en el ADN. El palíndromo tipo espejo es similar a los que se encuentran en el texto ordinario, en el que una secuencia se lee igual de adelante hacia atrás que de atrás hacia adelante en una sola cadena de ADN, como en GTAATG. El palíndromo de repetición invertida es también una secuencia que se lee igual de adelante hacia atrás que de atrás hacia adelante, pero las secuencias de adelante hacia atrás se encuentran en hebras de ADN complementarias (es decir, de ADN de doble cadena), como en GTATAC (GTATAC es complementario a CATATG). [ 29 ] Los palíndromos de repetición invertida son más comunes y tienen mayor importancia biológica que los palíndromos en espejo.

La digestión con EcoRI produce extremos "pegajosos" ,

mientras que la escisión por la enzima de restricción SmaI produce extremos "romos" :

Las secuencias de reconocimiento en el ADN difieren para cada enzima de restricción, produciendo diferencias en la longitud, la secuencia y la orientación de la cadena ( extremo 5' o extremo 3' ) de un extremo cohesivo "sobresaliente" de una restricción enzimática. [ 30 ]

Las distintas enzimas de restricción que reconocen la misma secuencia se conocen como isoesquizómeros . Las distintas enzimas que reconocen la misma ubicación, pero cortan en una posición diferente, se conocen como neoesquizómeros . [ 31 ]

Tipos

Las endonucleasas de restricción presentes de forma natural se clasifican en cinco grupos (Tipos I, II, III, IV y V) según su composición y requerimientos de cofactores enzimáticos , la naturaleza de su secuencia diana y la posición de su sitio de corte de ADN con respecto a la secuencia diana. [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ] Sin embargo, el análisis de la secuencia de ADN de las enzimas de restricción muestra grandes variaciones, lo que indica que existen más de cuatro tipos. [ 35 ] Todos los tipos de enzimas reconocen secuencias cortas de ADN específicas y llevan a cabo el corte endonucleolítico del ADN para producir fragmentos específicos con fosfatos terminales en el extremo 5'. Difieren en su secuencia de reconocimiento, composición de subunidades, posición de corte y requerimientos de cofactores, [ 36 ] [ 37 ] como se resume a continuación:

  • Las enzimas de tipo I ( EC 3.1.21.3 ) cortan en sitios alejados de un sitio de reconocimiento; requieren tanto ATP como S-adenosil-L-metionina para funcionar; proteína multifuncional con actividades de digestión por restricción y metilasa ( EC 2.1.1.72 ).
  • Las enzimas de tipo II ( EC 3.1.21.4 ) cortan dentro o a distancias cortas específicas de un sitio de reconocimiento; la mayoría requiere magnesio ; enzimas de función única (digestión por restricción) independientes de la metilasa.
  • Las enzimas de tipo III ( EC 3.1.21.5 ) escinden en sitios a corta distancia de un sitio de reconocimiento; requieren ATP (pero no lo hidrolizan); la S-adenosil-L-metionina estimula la reacción pero no es necesaria; existen como parte de un complejo con una metilasa de modificación ( EC 2.1.1.72 ).
  • Las enzimas de tipo IV actúan sobre el ADN modificado, por ejemplo, el ADN metilado, hidroximetilado y glucosil-hidroximetilado.
  • Las enzimas de tipo V utilizan ARN guía (ARNg).

Tipo l

Las enzimas de restricción de tipo I fueron las primeras en ser identificadas, en dos cepas diferentes (K-12 y B) de E. coli . [ 38 ] Estas enzimas cortan en un sitio que difiere y se encuentra a una distancia aleatoria (al menos 1000 pb) de su sitio de reconocimiento. La escisión en estos sitios aleatorios sigue un proceso de translocación de ADN, lo que demuestra que estas enzimas también son motores moleculares. El sitio de reconocimiento es asimétrico y está compuesto por dos porciones específicas: una que contiene 3-4 nucleótidos y otra que contiene 4-5 nucleótidos, separadas por un espaciador no específico de aproximadamente 6-8 nucleótidos. Estas enzimas son multifuncionales y son capaces de realizar actividades de restricción, digestión y modificación, dependiendo del estado de metilación del ADN diana. Los cofactores S-adenosilmetionina (AdoMet), adenosín trifosfato hidrolizado ( ATP ) e iones de magnesio (Mg²⁺ ) son necesarios para su actividad completa. Las enzimas de restricción de tipo I poseen tres subunidades llamadas HsdR, HsdM y HsdS; HsdR es necesaria para la digestión por restricción; HsdM es necesaria para agregar grupos metilo al ADN huésped (actividad metiltransferasa), y HsdS es importante para la especificidad del sitio de reconocimiento (unión al ADN), además de la digestión por restricción (corte del ADN) y la modificación (ADN metiltransferasa). [ 32 ] [ 38 ]

Tipo II

Las enzimas de restricción típicas de tipo II difieren de las de tipo I en varios aspectos. Forman homodímeros , con sitios de reconocimiento generalmente indivisos y palindrómicos, de 4 a 8 nucleótidos de longitud. Reconocen y cortan el ADN en el mismo sitio, y no utilizan ATP ni AdoMet para su actividad; normalmente solo requieren Mg²⁺ como cofactor. [ 28 ] Estas enzimas cortan el enlace fosfodiéster del ADN de doble hélice. Pueden cortar en el centro de ambas hebras para producir un extremo romo, o en una posición escalonada dejando extremos cohesivos. [ 40 ] Estas son las enzimas de restricción más comunes y utilizadas. En la década de 1990 y principios de la de 2000, se descubrieron nuevas enzimas de esta familia que no seguían todos los criterios clásicos de esta clase de enzimas, y se desarrolló una nueva nomenclatura de subfamilias para dividir esta gran familia en subcategorías basadas en desviaciones de las características típicas de las enzimas de tipo II. [ 28 ] Estos subgrupos se definen utilizando un sufijo de letra.

Las enzimas de restricción de tipo IIB (p. ej., BcgI y BplI) son multímeros , que contienen más de una subunidad. [ 28 ] Cortan el ADN a ambos lados de su reconocimiento para eliminar el sitio de reconocimiento. Requieren los cofactores AdoMet y Mg 2+ . Las endonucleasas de restricción de tipo IIE (p. ej., NaeI) cortan el ADN tras la interacción con dos copias de su secuencia de reconocimiento. [ 28 ] Un sitio de reconocimiento actúa como objetivo del corte, mientras que el otro actúa como un efector alostérico que acelera o mejora la eficiencia del corte enzimático. De forma similar a las enzimas de tipo IIE, las endonucleasas de restricción de tipo IIF (p. ej., NgoMIV) interactúan con dos copias de su secuencia de reconocimiento, pero cortan ambas secuencias al mismo tiempo. [ 28 ] Las endonucleasas de restricción de tipo IIG (p. ej., RM.Eco57I) tienen una sola subunidad, como las enzimas de restricción clásicas de tipo II, pero requieren el cofactor AdoMet para ser activas. [ 28 ] Las endonucleasas de restricción de tipo IIM, como DpnI , pueden reconocer y cortar ADN metilado. [ 28 ] [ 41 ] [ 42 ] Las endonucleasas de restricción de tipo IIS (por ejemplo, FokI) cortan el ADN a una distancia definida de sus sitios de reconocimiento asimétricos no palindrómicos; [ 28 ] esta característica se utiliza ampliamente para realizar técnicas de clonación in vitro como la clonación Golden Gate . Estas enzimas pueden funcionar como dímeros . De manera similar, las enzimas de restricción de tipo IIT (por ejemplo, Bpu10I y BslI) están compuestas por dos subunidades diferentes. Algunas reconocen secuencias palindrómicas, mientras que otras tienen sitios de reconocimiento asimétricos. [ 28 ]

Tipo III

Las enzimas de restricción de tipo III (p. ej., EcoP15) reconocen dos secuencias no palindrómicas separadas que están orientadas inversamente. Cortan el ADN aproximadamente 20–30 pares de bases después del sitio de reconocimiento. [ 43 ] Estas enzimas contienen más de una subunidad y requieren los cofactores AdoMet y ATP para sus funciones en la metilación del ADN y la digestión por restricción , respectivamente. [ 44 ] Son componentes de los mecanismos de restricción-modificación del ADN procariota que protegen al organismo contra el ADN extraño invasor. Las enzimas de tipo III son proteínas hetero-oligoméricas multifuncionales compuestas por dos subunidades, Res ( P08764 ) y Mod ( P08763 ). La subunidad Mod reconoce la secuencia de ADN específica para el sistema y es una metiltransferasa de modificación ; como tal, es funcionalmente equivalente a las subunidades M y S de la endonucleasa de restricción de tipo I. Res es necesaria para la digestión por restricción, aunque no tiene actividad enzimática por sí misma. Las enzimas de tipo III reconocen secuencias de ADN asimétricas cortas de 5 a 6 pb y cortan de 25 a 27 pb corriente abajo para dejar cortas protrusiones 5' monocatenarias. Requieren la presencia de dos sitios de reconocimiento no metilados orientados inversamente para que se produzca la digestión por restricción. Estas enzimas metilan solo una hebra del ADN, en la posición N-6 de los residuos de adenina, por lo que el ADN recién replicado tendrá solo una hebra metilada, lo cual es suficiente para protegerlo contra la digestión por restricción. Las enzimas de tipo III pertenecen a la subfamilia beta de las N6 adenina metiltransferasas , que contienen los nueve motivos que caracterizan a esta familia, incluyendo el motivo I, el bolsillo de unión de AdoMet (FXGXG), y el motivo IV, la región catalítica (S/D/N (PP) Y/F). [ 36 ] [ 45 ]

Tipo IV

Las enzimas de tipo IV reconocen el ADN modificado, típicamente metilado , y están ejemplificadas por los sistemas  McrBC  y Mrr de E. coli . [ 35 ] 

Tipo V

Las enzimas de restricción de tipo V (por ejemplo, el complejo cas9 -gRNA de CRISPR [ 46 ] ) utilizan ARN guía para dirigirse a secuencias no palindrómicas específicas presentes en organismos invasores. Pueden cortar ADN de longitud variable, siempre que se les proporcione un ARN guía adecuado. La flexibilidad y facilidad de uso de estas enzimas las hacen prometedoras para futuras aplicaciones de ingeniería genética . [ 46 ] [ 47 ]

enzimas de restricción artificiales

Las enzimas de restricción artificiales se pueden generar fusionando un dominio de unión al ADN natural o modificado a un dominio nucleasa (a menudo el dominio de escisión de la enzima de restricción FokI de tipo IIS ). [ 48 ] Estas enzimas de restricción artificiales pueden dirigirse a sitios de ADN grandes (hasta 36 pb) y pueden modificarse para unirse a secuencias de ADN deseadas. [ 49 ] Las nucleasas de dedos de zinc son las enzimas de restricción artificiales más utilizadas y se emplean generalmente en aplicaciones de ingeniería genética , [ 50 ] [ 51 ] [ 52 ] [ 53 ] pero también pueden utilizarse para aplicaciones de clonación de genes más estándar . [ 54 ] Otras enzimas de restricción artificiales se basan en el dominio de unión al ADN de los efectores TAL . [ 55 ] [ 56 ]

En 2013, se desarrolló una nueva tecnología, CRISPR-Cas9 , basada en un sistema de defensa viral procariota, para la edición del genoma, y ​​fue rápidamente adoptada en los laboratorios. [ 57 ] Para más detalles, consulte CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y espaciadas regularmente).

En 2017, un grupo de la Universidad de Illinois informó sobre el uso de una proteína Argonaute tomada de Pyrococcus furiosus (PfAgo) junto con ADN guía para editar ADN in vitro como enzimas de restricción artificiales. [ 58 ]

También se han desarrollado ribonucleasas artificiales que actúan como enzimas de restricción para el ARN . Un sistema basado en PNA , denominado PNAzima, posee un grupo Cu(II) -2,9-dimetilfenantrolina que imita a las ribonucleasas para secuencias de ARN específicas y realiza el corte en una región sin apareamiento de bases (protuberancia de ARN) del ARN diana que se forma cuando la enzima se une al ARN. Esta enzima muestra selectividad al cortar únicamente en un sitio que no presenta un desajuste o que es cinéticamente preferido entre dos posibles sitios de corte. [ 59 ]

Nomenclatura

Desde su descubrimiento en la década de 1970, se han identificado muchas enzimas de restricción; por ejemplo, se han caracterizado más de 3500 enzimas de restricción de tipo II diferentes. [ 60 ] Cada enzima recibe el nombre de la bacteria de la que fue aislada, utilizando un sistema de nomenclatura basado en el género , la especie y la cepa bacteriana . [ 61 ] [ 62 ] Por ejemplo, el nombre de la enzima de restricción EcoRI se derivó como se muestra en el recuadro.

Aplicaciones

Las enzimas de restricción aisladas se utilizan para manipular el ADN con diferentes aplicaciones científicas.

Se utilizan para facilitar la inserción de genes en vectores plasmídicos durante experimentos de clonación genética y producción de proteínas . Para un uso óptimo, los plásmidos comúnmente empleados en la clonación genética se modifican para incluir una secuencia polienlazadora corta (denominada sitio de clonación múltiple o SCM) rica en secuencias de reconocimiento de restricción . Esto permite flexibilidad al insertar fragmentos génicos en el vector plasmídico; los sitios de restricción presentes de forma natural en los genes influyen en la elección de la endonucleasa para la digestión del ADN, ya que es necesario evitar la restricción del ADN deseado al cortar intencionalmente los extremos del ADN. Para clonar un fragmento génico en un vector, tanto el ADN plasmídico como el inserto génico se cortan típicamente con las mismas enzimas de restricción y luego se unen con la ayuda de una enzima conocida como ADN ligasa . [ 63 ] [ 64 ]

Las enzimas de restricción también se pueden usar para distinguir alelos de genes al reconocer específicamente cambios de una sola base en el ADN conocidos como polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [ 65 ] [ 66 ] Sin embargo, esto solo es posible si un SNP altera el sitio de restricción presente en el alelo. En este método, la enzima de restricción se puede usar para genotipificar una muestra de ADN sin necesidad de una costosa secuenciación genética . La muestra se digiere primero con la enzima de restricción para generar fragmentos de ADN, y luego los fragmentos de diferentes tamaños se separan por electroforesis en gel . En general, los alelos con sitios de restricción correctos generarán dos bandas visibles de ADN en el gel, y aquellos con sitios de restricción alterados no se cortarán y generarán solo una banda. También se puede generar un mapa de ADN por digestión con restricción que puede dar las posiciones relativas de los genes . [ 67 ] Las diferentes longitudes de ADN generadas por la digestión con restricción también producen un patrón específico de bandas después de la electroforesis en gel, y se pueden usar para la huella genética del ADN .

De manera similar, las enzimas de restricción se utilizan para digerir el ADN genómico para el análisis genético mediante Southern blot . Esta técnica permite a los investigadores identificar cuántas copias (o parálogos ) de un gen están presentes en el genoma de un individuo, o cuántas mutaciones genéticas ( polimorfismos ) han ocurrido dentro de una población. Este último ejemplo se denomina polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP). [ 68 ]

Las enzimas de restricción artificiales creadas mediante la unión del dominio de escisión de ADN FokI con una matriz de proteínas de unión al ADN o matrices de dedos de zinc, denominadas nucleasas de dedos de zinc (ZFN), son una herramienta poderosa para la edición del genoma del huésped debido a su especificidad de secuencia mejorada. Las ZFN funcionan en pares, y su dimerización se produce in situ a través del dominio FokI. Cada matriz de dedos de zinc ( ZFA ) es capaz de reconocer de 9 a 12 pares de bases, lo que da como resultado de 18 a 24 pares. Un espaciador de 5 a 7 pb entre los sitios de escisión mejora aún más la especificidad de las ZFN, convirtiéndolas en una herramienta segura y más precisa que puede aplicarse en humanos. Recientemente se ha llevado a cabo un ensayo clínico de fase I de ZFN para la abolición dirigida del correceptor CCR5 del VIH-1 . [ 69 ]

Otros han propuesto utilizar el sistema RM bacteriano como modelo para diseñar vacunas y terapias genéticas o antivirales humanas, ya que el sistema RM cumple una función de defensa innata en las bacterias al restringir el tropismo de los bacteriófagos . [ 70 ] Hay investigaciones sobre REasas y ZFN que pueden cortar el ADN de varios virus humanos, incluidos HSV-2 , VPH de alto riesgo y VIH-1, con el objetivo final de inducir mutagénesis dirigida y aberraciones de virus que infectan a humanos. [ 71 ] [ 72 ] [ 73 ] El genoma humano ya contiene restos de genomas retrovirales que han sido inactivados y aprovechados para beneficio propio. De hecho, los mecanismos para silenciar los retroelementos genómicos L1 activos por la exonucleasa de reparación tres prima 1 ( TREX1 ) y la reparación por escisión de complementación cruzada 1 (ERCC) parecen imitar la acción de los sistemas RM en bacterias y la unión de extremos no homólogos (NHEJ) que sigue al uso de ZFN sin una plantilla de reparación. [ 74 ] [ 75 ]

Ejemplos

Ejemplos de enzimas de restricción incluyen: [ 76 ]

Clave: * = extremos romos N = C o G o T o A W = A o T

Véase también

Referencias

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