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Espectroscopia Raman de resonancia

Diagrama de niveles de energía que muestra la relación entre la dispersión de Rayleigh, Raman y Raman resonante y la fluorescencia. La espectroscopia Raman de resonancia ( espec...

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Diagrama de niveles de energía que muestra la dispersión y la fluorescencia.
Diagrama de niveles de energía que muestra la relación entre la dispersión de Rayleigh, Raman y Raman resonante y la fluorescencia.

La espectroscopia Raman de resonancia ( espectroscopia RR o RRS ) es una variante de la espectroscopia Raman en la que la energía del fotón incidente es cercana a la de una transición electrónica del compuesto o material analizado. [ 1 ] Esta similitud energética ( resonancia ) produce un aumento considerable en la intensidad de la dispersión Raman de ciertos modos vibracionales, en comparación con la espectroscopia Raman convencional.

La espectroscopia Raman de resonancia tiene una sensibilidad mucho mayor que la espectroscopia Raman sin resonancia, lo que permite el análisis de compuestos con intensidades de dispersión Raman inherentemente débiles o a concentraciones muy bajas. [ 2 ] [ 3 ] También mejora selectivamente solo ciertas vibraciones moleculares (las del grupo químico que experimenta la transición electrónica), lo que simplifica los espectros. [ 3 ] Para moléculas grandes como las proteínas , esta selectividad ayuda a identificar modos vibracionales de partes específicas de la molécula o proteína , como la unidad hemo dentro de la mioglobina . [ 4 ] La espectroscopia Raman de resonancia se ha utilizado en la caracterización de compuestos y complejos inorgánicos, [ 5 ] proteínas, [ 6 ] [ 7 ] ácidos nucleicos, [ 8 ] pigmentos, [ 8 ] y en arqueología e historia del arte. [ 8 ]

Teoría

En la dispersión Raman, los fotones colisionan con una muestra y se dispersan con una diferencia de energía: los fotones dispersados ​​pueden tener mayor o menor energía (una longitud de onda más corta o más larga ) que los fotones incidentes. Esta diferencia de energía se debe al acoplamiento del fotón con las vibraciones de la muestra, lo que resulta en una transición a un nivel de energía vibracional más alto o más bajo: si la muestra se encontraba inicialmente en un estado vibracional elevado, el fotón dispersado puede tener mayor energía que el fotón incidente ( dispersión Raman anti-Stokes ). En caso contrario, el fotón dispersado tiene menor energía que el fotón incidente ( dispersión Raman Stokes ). Entre los dos fenómenos, el desplazamiento Stokes y el desplazamiento anti-Stokes, el primero es el más probable. En consecuencia, la intensidad relativa de los espectros Raman adquiridos en modo Stokes es mayor que la del otro. Para la mayoría de los materiales, la dispersión Raman es extremadamente débil en comparación con la dispersión Rayleigh , en la que la luz se dispersa sin pérdida de energía. [ 9 ] Por lo tanto , la luz dispersada por Raman, que contiene información sobre las transiciones vibracionales , es difícil de observar para muchas sustancias.

La espectroscopia Raman de resonancia aprovecha un aumento en la intensidad de la sección transversal de dispersión Raman cuando los fotones incidentes coinciden con la energía de una transición electrónica . Si la energía del fotón que incide sobre la muestra es igual o cercana a la de una transición electrónica en la muestra, ciertos modos vibracionales activos en Raman —aquellos que producen desplazamiento nuclear en la misma dirección que la transición electrónica [ 10 ] — exhibirán una dispersión mucho mayor, hasta 10⁶ veces mayor en comparación con el Raman no resonante. [ 3 ] Para los modos totalmente simétricos , esta mayor intensidad de dispersión resulta de la llamada dispersión de término A o de Franck-Condon , debido a las superposiciones de Franck-Condon no nulas entre los estados fundamental y excitado. Los modos no totalmente simétricos también pueden verse mejorados por la dispersión de término B o de Herzberg-Teller, si la simetría del modo está contenida en el producto directo de las simetrías de los dos estados electrónicos. [ 11 ] La mejora de la resonancia es más evidente en el caso de las transiciones π-π* y menos evidente para las transiciones centradas en el metal (d–d) . [ 5 ] Al igual que la espectroscopia Raman ordinaria, la RRS observa transiciones vibracionales que producen un cambio distinto de cero en la polarizabilidad de la molécula o material que se está estudiando.

La dispersión Raman resonante se diferencia de la fluorescencia en que ocurre sin relajación vibracional durante la vida útil del estado electrónico excitado. Por lo tanto, presenta anchos de línea mucho más estrechos que la fluorescencia. [ 11 ] Sin embargo, la fluorescencia y la dispersión Raman resonante coexisten en muchos materiales, y la interferencia de la fluorescencia puede complicar la obtención de espectros Raman resonantes. [ 3 ]

Variantes

Por lo general, la espectroscopia Raman de resonancia se realiza de la misma manera que la espectroscopia Raman convencional, utilizando una única fuente de luz láser para iluminar la muestra. La diferencia radica en la elección de la longitud de onda del láser, que debe seleccionarse para que coincida con la energía de una transición electrónica en la muestra. Por lo tanto, se suele utilizar un láser sintonizable para la espectroscopia Raman de resonancia, ya que un solo láser puede generar muchas longitudes de onda posibles para adaptarse a diferentes muestras. [ 8 ] Mediante el uso de múltiples láseres, láseres pulsados ​​y/o ciertas técnicas de preparación de muestras, se puede realizar una gama de variantes más sofisticadas de RRS, que incluyen:

  • Espectroscopia Raman de resonancia resuelta en el tiempo : Mediante el uso de láseres pulsados ​​con un retardo controlable entre pulsos, la espectroscopia Raman de resonancia puede utilizarse para monitorizar los cambios en la muestra a lo largo del tiempo, tras un cambio fotoquímico inducido por láser o un aumento de temperatura. [ 12 ] Este método se ha utilizado para examinar la dinámica de los estados electrónicos excitados, [ 13 ] la unión de oxígeno u otros gases a proteínas que contienen hemo , [ 14 ] y la dinámica de las proteínas . [ 12 ] [ 15 ]
  • Espectroscopia hiper-Raman de resonancia : La excitación de la muestra se produce por absorción de dos fotones , en lugar de por absorción de un solo fotón. Esta configuración permite la excitación de modos prohibidos en la espectroscopia Raman de resonancia convencional, con un aumento de intensidad debido a la resonancia, y también simplifica la recolección de la luz dispersa. Es especialmente útil para moléculas que son polares y polarizables. [ 16 ]
  • Espectroscopia Raman de resonancia intensificada en superficie : Un híbrido de RRS y dispersión Raman intensificada en superficie . La muestra se aplica a nanopartículas conductoras y se utiliza como fuente un láser cuya longitud de onda coincide con la resonancia del plasmón superficial de las nanopartículas. Si la longitud de onda del plasmón superficial coincide con la de una transición electrónica en la muestra, la dispersión Raman se intensificará notablemente en comparación con la RRS convencional. [ 17 ]
  • Microscopía Raman de resonancia : Se utiliza un microscopio para enfocar el láser de la fuente en un punto específico de la muestra, y se recogen espectros para muchos de estos puntos. La intensidad Raman en diferentes puntos se puede ensamblar para formar una imagen microscópica de la muestra. Mediante una selección adecuada de la longitud de onda de la fuente, se puede crear un mapa microscópico de la distribución de un componente de interés. [ 18 ]

Aplicaciones

Ejemplo de espectros Raman de resonancia y no resonancia
Espectros Raman de resonancia (arriba) y no resonancia (abajo) de MoS₂ sobre silicio. Nótese que el uso de una longitud de onda de fuente de 633 nm, cercana a una transición electrónica, provoca la aparición de bandas demasiado débiles para ser visibles con una fuente de 532 nm. Figura cortesía de David Tuschel.

Debido a su selectividad y sensibilidad, la espectroscopia Raman de resonancia se utiliza habitualmente para estudiar las vibraciones moleculares en compuestos que presentarían espectros Raman muy débiles o complejos en ausencia de intensificación por resonancia. Al igual que la espectroscopia Raman convencional, la espectroscopia Raman de resonancia es compatible con muestras en agua, que presenta una intensidad de dispersión muy baja y una escasa contribución a los espectros. Sin embargo, la necesidad de un láser fuente con una longitud de onda que coincida con la de una transición electrónica en el analito de interés limita en cierta medida la aplicabilidad del método. [ 8 ]

Pigmentos y tintes

Los colorantes y pigmentos, que presentan transiciones electrónicas en la parte visible del espectro electromagnético , fueron de las primeras sustancias estudiadas mediante espectroscopia Raman de resonancia. En 1970 se publicaron los espectros Raman de resonancia del betacaroteno y el licopeno en muestras vegetales intactas. [ 8 ] Desde entonces, el método se ha utilizado para medir de forma no invasiva los niveles de estos nutrientes en la piel humana. [ 19 ] Los espectros Raman de resonancia de otros pigmentos poliénicos, como el esferoideno y el retinal , se han utilizado para identificar diferencias en la conformación del cromóforo en proteínas fotoactivas. [ 20 ] [ 21 ] La espectroscopia Raman de resonancia se ha utilizado en arqueología para identificar colorantes y pigmentos en artefactos culturales, y su capacidad para distinguir diferentes tintas y colorantes modernos ha encontrado aplicación en la ciencia forense . [ 8 ]

Proteínas

Las proteínas se han examinado ampliamente mediante espectroscopia Raman de resonancia. Los cofactores unidos a proteínas que absorben en el rango de longitud de onda visible, como el hemo , las flavinas o los complejos de metales de transición , pueden examinarse mediante RRS con una superposición espectral mínima del resto de la molécula. [ 7 ] [ 22 ] Este método se ha utilizado para examinar la unión de gases en hemoproteínas [ 23 ] y el ciclo catalítico de varias enzimas. [ 24 ] Utilizando excitación láser ultravioleta , es posible excitar selectivamente las cadenas laterales de aminoácidos aromáticos ( fenilalanina , tirosina y triptófano ) para deducir el entorno local y las interacciones de enlaces de hidrógeno de estos residuos. [ 25 ] Con excitación ultravioleta de longitud de onda más corta ("profunda"), también es posible excitar los enlaces peptídicos de una proteína para examinar la estructura secundaria . El plegamiento y la desnaturalización de las proteínas se han examinado utilizando espectroscopia Raman de resonancia en el ultravioleta profundo de la cadena principal del polipéptido, con longitudes de onda de excitación inferiores a 200 nm. [ 25 ]

Ácidos nucleicos y virus

La espectroscopia Raman de resonancia con excitación ultravioleta se puede utilizar para examinar la química, la estructura y las interacciones intermoleculares de los ácidos nucleicos , específicamente las bases. Las interacciones entre los ácidos nucleicos y los compuestos que se unen al ADN, como los fármacos, se pueden examinar excitando selectivamente las nucleobases o el propio fármaco. [ 8 ] Los espectros Raman de resonancia del ADN se pueden utilizar para identificar el ADN bacteriano en células vivas, cuantificarlo en diferentes condiciones de cultivo e incluso distinguir diferentes especies bacterianas. [ 8 ] Los virus también se han estudiado utilizando espectroscopia Raman de resonancia UV; este método permite analizar por separado la estructura del ácido nucleico o de los componentes de la proteína de la cápside del virus, mediante la elección de la longitud de onda de excitación adecuada. [ 26 ]

nanomateriales

La espectroscopia Raman de resonancia también se ha utilizado para caracterizar la estructura y las propiedades fotofísicas de las nanopartículas . Mediante láseres sintonizados a las transiciones electrónicas visibles e infrarrojas cercanas de los nanotubos de carbono , es posible potenciar las bandas vibracionales sensibles a la estructura de los nanotubos. [ 8 ] También se ha demostrado que los nanocables de materiales semiconductores inorgánicos, como el fosfuro de galio y el telururo de mercurio encapsulado en carbono, presentan espectros Raman de resonancia con luz de excitación visible. [ 27 ] [ 28 ]

Véase también

Referencias

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Lecturas adicionales

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