reacción en cadena de la polimerasa de complemento inverso

La reacción en cadena de la polimerasa con complemento inverso (RC-PCR) es una modificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Se utiliza principalmente para generar bibliotecas de amplicones para la secuenciación de ADN mediante secuenciación de nueva generación (NGS). Esta técnica permite tanto la amplificación como la adición independiente de secuencias o dominios funcionales específicos a cualquiera de los extremos de los amplicones generados en una única reacción en tubo cerrado. La RC-PCR fue inventada en 2013 por Daniel Ward y Christopher Mattocks en el Salisbury NHS Foundation Trust , Reino Unido.

En la PCR-RC, no hay cebadores específicos para la secuencia diana en la mezcla de reacción. En cambio, estos cebadores se forman a medida que avanza la reacción. Una reacción típica que emplea este método requiere cuatro oligonucleótidos . Los oligonucleótidos interactúan entre sí en pares: una sonda de oligonucleótido y un cebador universal (que contiene dominios funcionales específicos), los cuales se hibridan entre sí en sus extremos 3'. Una vez hibridado, el cebador universal puede extenderse, utilizando la sonda de oligonucleótido como molde, para generar cebadores específicos para la secuencia diana, que luego están disponibles para amplificar el molde en rondas posteriores de termociclado, como en una reacción de PCR estándar.

La sonda de oligonucleótidos también puede bloquearse en el extremo 3', impidiendo su extensión, aunque esto no es esencial. La sonda no se consume; permanece disponible como molde para que el cebador universal se convierta en un cebador específico para la secuencia diana durante los sucesivos ciclos de PCR. Esta generación del cebador específico se produce en paralelo con la amplificación por PCR estándar, bajo condiciones estándar.

La PCR en tubo cerrado ofrece ventajas significativas sobre otros métodos de preparación de bibliotecas de amplicones. La más importante es que se trata de una reacción en un solo tubo cerrado, lo que elimina la contaminación cruzada asociada con otros métodos de PCR de dos pasos, además de utilizar menos reactivos y requerir menos mano de obra.

Esta técnica también ofrece la importante ventaja de la flexibilidad para añadir cualquier secuencia o dominio funcional deseado a cualquiera de los extremos de cualquier amplicón. Esto resulta especialmente ventajoso en los laboratorios modernos de secuenciación de nueva generación (NGS), donde se puede utilizar un único par de sondas específicas para la diana con una biblioteca completa de cebadores universales. Esta ventaja se aprovecha en las aplicaciones de NGS para aplicar índices específicos de la muestra de forma independiente a cada extremo del constructo del amplicón. Un laboratorio que emplee este enfoque solo necesitaría un único conjunto de cebadores de índice, que puede utilizarse con todas las sondas específicas para la diana compatibles con dicho conjunto de índices. Esto reduce significativamente el número y la longitud de los oligonucleótidos necesarios para el laboratorio en comparación con el uso de cebadores específicos para la diana presintetizados de longitud completa.

La generación del cebador específico para la molécula diana durante la reacción, a medida que esta progresa, también da lugar a componentes de reacción más equilibrados. Las concentraciones del cebador específico se ajustan mejor a la concentración de la molécula diana, lo que reduce la posibilidad de cebado inespecífico y dimerización del cebador.

• PCR multiplex RC: en la que se incluyen dos o más conjuntos de sondas y cebadores universales en la mezcla de reacción para amplificar dos o más objetivos simultáneamente.
• RT-PCR-RC: Esta modificación se utiliza cuando el material molde proporcionado en la reacción es ARN en lugar de ADN . En esta modificación, la mezcla de reacción también contiene enzimas transcriptasa inversa y cebadores de transcripción inversa , así como los cebadores universales y las sondas de complemento inverso del método. Este enfoque permite la transcripción inversa del ARN molde proporcionado, la formación de cebadores específicos para el objetivo con cola y la amplificación de los objetivos deseados en una única reacción en tubo cerrado.
• RC-PCR de terminación simple: esta variante del método se utiliza cuando solo se proporciona un par de sondas de cebadores universales complementarios en la reacción para generar un cebador específico para el objetivo. El otro cebador específico para el objetivo se proporciona como un cebador tradicional según la PCR estándar .

Tras la invención de la RC-PCR en 2013, la técnica fue validada clínicamente y empleada con fines diagnósticos para diversas enfermedades hereditarias, como la hemocromatosis y la trombofilia, así como para trastornos somáticos adquiridos, incluyendo neoplasias mieloproliferativas y leucemia mieloide aguda, en el Laboratorio Regional de Genética de Wessex (WRGL), Salisbury, Reino Unido. Tras el brote de la pandemia de SARS-CoV-2, también se trabajó en el laboratorio de Salisbury utilizando esta tecnología para desarrollar un método altamente escalable para la detección simultánea del SARS-CoV-2 y la tipificación de variantes de interés. ^{[ 1 ]}

La solicitud de patente se presentó en el Reino Unido en 2015 y se concedió en 2020. Se han presentado solicitudes de patente en otras jurisdicciones de todo el mundo, las cuales se encuentran actualmente en trámite.

En mayo de 2019, la propiedad intelectual fue licenciada a Nimagen BV ^{[ 2 ]} para desarrollar, fabricar y comercializar kits que explotan la tecnología. Actualmente, los kits disponibles comercialmente que emplean la tecnología incluyen aquellos para la identificación humana ^{[ 3 ] [ 4 ]} y para la secuenciación del genoma completo del virus SARS-CoV-2 para la identificación de variantes, seguimiento y respuesta al tratamiento. ^{[ 5 ] [ 6 ] [ 7 ]} En agosto de 2022, Nimagen lanzó oficialmente una gama de productos que emplean la tecnología RC-PCR para aplicaciones forenses humanas bajo la marca registrada IDseek®. La versión de repetición en tándem corta del kit está validada por el Instituto Forense de los Países Bajos como un método mejorado para la secuenciación masiva paralela rutinaria de repeticiones en tándem cortas. ^{[ 8 ]}

El método RC-PCR se está utilizando cada vez más en el ámbito de la salud humana, y existen varios kits CE IVD disponibles para el diagnóstico clínico humano, incluyendo el análisis de BRCA , TP53 , PALB2 y CFTR . Esta técnica también ha demostrado ser una herramienta útil y potente para la identificación del patógeno infeccioso causante en pacientes con sospecha de infección bacteriana. En este contexto, se ha demostrado que proporciona un aumento significativo en el número de muestras clínicas en las que se identifica un patógeno potencialmente relevante desde el punto de vista clínico, en comparación con el método 16S Sanger de uso común. ^{[ 9 ]} Asimismo, se ha demostrado que ofrece ventajas similares sobre los métodos tradicionales en la deconvolución de comunidades microbianas en muestras ambientales, ^{[ 10 ]} y, cuando se utiliza junto con dispositivos Oxford Nanopore, ha demostrado ser un método eficiente para la secuenciación completa del gen 16S rRNA para la deconvolución de comunidades microbianas. ^{[ 11 ]}

• Animación RC-PCR
• Página de información sobre la presentación de solicitudes de patentes de la OMPI