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Cromatografía de fase inversa

La cromatografía líquida de fase inversa ( RP-LC ) es un modo de cromatografía líquida en el que se utilizan fases estacionarias no polares y fases móviles polares para la separ...

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La cromatografía líquida de fase inversa ( RP-LC ) es un modo de cromatografía líquida en el que se utilizan fases estacionarias no polares y fases móviles polares para la separación de compuestos orgánicos. [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ] En el modo de fase inversa, los componentes más hidrofóbicos de la muestra se retienen en el sistema durante más tiempo. La gran mayoría de las separaciones y análisis que utilizan cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en los últimos años se realizan utilizando el modo de fase inversa. [ 4 ] Desarrollada inicialmente para la separación de biomoléculas, ahora es una técnica general con muchas fases estacionarias disponibles para su uso en RP-LC, lo que permite una gran flexibilidad en el desarrollo de los métodos de separación. [ 5 ] [ 6 ]

En la cromatografía líquida de fase inversa (RP-LC), existen algunos factores que influyen en cómo se retienen y separan los componentes:

  • La naturaleza química de la fase estacionaria . La fase estacionaria puede recubrirse con algunos ligandos con diferentes densidades de enlace (cuántos ligandos se unen por área de superficie).
  • Composición de la fase móvil . La fase móvil puede estar compuesta por un solo disolvente o por una mezcla de varios. Los disolventes pueden mezclarse en diferentes proporciones. Las distintas fases móviles presentan propiedades diferentes, como la polaridad . Cuando una fase móvil se compone principalmente de un disolvente, con la adición de otros disolventes en pequeñas cantidades, estos últimos se denominan "modificadores de la fase móvil".
  • El pH de la fase móvil , que afecta el estado de ionización de los solutos y su polaridad. Esto se puede modificar con aditivos como tampones .

Generalmente, la fase estacionaria está compuesta por una capa de sustrato hidrofóbico adherida a la superficie de partículas de gel de sílice poroso . Estas partículas presentan diversas formas (esféricas, irregulares), distintos diámetros (menos de 2, 3, 5, 7 y 10 μm ) y diámetros de poro variables (60, 100, 150 y 300 Å ). Los diámetros de las partículas suelen expresarse como números de malla . Por ejemplo, una malla de 2500 corresponde a un diámetro de partícula de 5 μm. Los sustratos hidrofóbicos suelen ser cadenas alquílicas , como C3, C4, C8, C18 o superiores. Cuanto más larga sea la cadena, mayor será la retención de los componentes de la muestra. Esto aumenta el poder de resolución, pero también prolonga el tiempo de ejecución de la cromatografía. La mayoría de los métodos actuales de separación de materiales biomédicos utilizan columnas C18, a veces denominadas por nombres comerciales como ODS ( octadecilsilano ) o RP-18 (fase inversa 18).

Las columnas de fase inversa convencionales basadas en sílice funcionan mejor en un rango de pH moderado. A pH muy bajo o muy alto, la superficie de sílice y la capa hidrofóbica adherida pueden degradarse. Para la cromatografía líquida de fase inversa (RP-LC) en condiciones muy ácidas o alcalinas, se pueden utilizar partículas poliméricas hidrofóbicas o partículas híbridas de sílice con grupos orgánicos.

Las partículas poliméricas hidrofóbicas se fabrican a partir de un polímero orgánico en lugar de sílice. Un ejemplo común es el poliestireno - divinilbenceno (PS-DVB). La partícula en sí es hidrofóbica, por lo que los compuestos orgánicos pueden adsorberse directamente sobre ella.

La sílice pura se disuelve en condiciones alcalinas. Las partículas híbridas sílice-orgánicas son aquellas cuya estructura contiene tanto unidades de sílice como grupos orgánicos. Una estructura típica es similar a: Si–O–Si mezclado con Si–R–Si, donde R es un enlace orgánico, como un grupo etileno . Esto hace que la partícula sea más resistente a las condiciones alcalinas.

Las fases móviles son mezclas de agua y disolventes orgánicos polares, generalmente metanol y acetonitrilo . Estas mezclas suelen contener diversos aditivos, como tampones ( acetato , fosfato , citrato ), tensioactivos ( alquilaminas o alquilsulfonatos ) y aditivos especiales ( EDTA ). El objetivo de utilizar estos aditivos es aumentar la eficiencia, la selectividad y controlar la retención del soluto.

Fases estacionarias

La historia y evolución de las fases estacionarias de fase inversa se describe en detalle en un artículo de Majors, Dolan, Carr y Snyder. [ 7 ]

En la década de 1970, la mayoría de las cromatografías líquidas se realizaban utilizando partículas sólidas como fases estacionarias, compuestas de gel de sílice o alúmina sin modificar . Este tipo de técnica se conoce ahora como cromatografía de fase normal . En la cromatografía de fase normal, la fase estacionaria es hidrofílica y la fase móvil es no polar/hidrofóbica, compuesta por disolventes orgánicos como el hexano y el heptano .

Sin embargo, la cromatografía de fase normal no es adecuada para muchas biomoléculas, por lo que se desarrolló la cromatografía de fase inversa. En concreto, muchas biomoléculas son polares, por lo que no se disuelven bien en una fase móvil no polar.

En la fase inversa, la fase móvil es polar, lo que disuelve bien las moléculas hidrófilas. El uso de una fase estacionaria no polar y fases móviles polares es esencialmente lo contrario de la cromatografía de fase normal, ya que la polaridad de las fases móvil y estacionaria se ha invertido; de ahí el término cromatografía de fase inversa. [ 8 ] [ 9 ] Como resultado, las moléculas hidrófobas en la fase móvil polar tienden a adsorberse a la fase estacionaria hidrófoba, y las moléculas hidrófilas en la muestra pasan a través de la columna y se eluyen primero. [ 8 ] [ 10 ] Las moléculas hidrófobas se pueden eluir de la columna disminuyendo la polaridad de la fase móvil mediante un disolvente orgánico (no polar), lo que reduce las interacciones hidrófobas. Cuanto más hidrófoba sea la molécula, más fuertemente se unirá a la fase estacionaria y mayor será la concentración de disolvente orgánico que se requerirá para eluir la molécula.

El tamaño de los poros también influye. Una partícula con poros pequeños impediría que las moléculas grandes accedieran a la mayor parte de su superficie. Esto significa que las moléculas más grandes tendrían un menor tiempo de retención que las más pequeñas, incluso si son químicamente similares.

Muchos de los parámetros matemáticos de la teoría de la cromatografía y las consideraciones experimentales utilizadas en otros métodos cromatográficos también se aplican a la RP-LC (por ejemplo, el factor de selectividad, la resolución cromatográfica, el número de platos teóricos, etc.). [ 11 ]

Fases estacionarias a base de sílice

Dibujo idealizado del gel de sílice antes y después del tratamiento con octadecil triclorosilano ( C 18 H 37 SiCl 3 . La mayoría de los grupos silanol (rojo) se convierten en grupos alquilsiloxi hidrofóbicos. [ 12 ]

Las partículas de gel de sílice se utilizan comúnmente como fase estacionaria en cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) por varias razones: [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]

  1. Las partículas de gel de sílice tienen una gran superficie para que se produzcan interacciones, ya sea con solutos o mediante enlaces con ligandos.
  2. El gel de sílice no reacciona con muchos tipos de disolventes y analitos.
  3. El gel de sílice puede modificarse con diversos grupos funcionales.
  4. El gel de sílice es barato.
  5. Las partículas de gel de sílice son fáciles de moldear para obtener diámetros, formas, tamaños de poro, etc. específicos.

La partícula de sílice puede tener diferentes formas. Puede ser completamente sólida ("monolítica" o "fusionada"), estar llena de agujeros ("porosa") o tener un núcleo sólido y una capa porosa ("superficialmente porosa"). La partícula puede tener diferentes diámetros. Los poros también pueden tener diferentes diámetros. [ 17 ]

La Farmacopea de los Estados Unidos (USP) ha clasificado las columnas de HPLC por tipos L#. [ 18 ] La columna más popular en esta clasificación es una sílice unida a una cadena de carbono octadecilo (C18) (clasificación USP L1). [ 19 ] A esta le siguen la sílice unida a C8 (L7), sílice pura (L3), sílice unida a ciano (CN) (L10) y sílice unida a fenilo (L11). Tenga en cuenta que C18, C8 y fenilo son fases estacionarias dedicadas de fase inversa, mientras que las columnas CN pueden usarse en un modo de fase inversa dependiendo de las condiciones del analito y la fase móvil. No todas las columnas C18 tienen propiedades de retención idénticas. La funcionalización de la superficie de la sílice puede realizarse en una reacción monomérica o polimérica con diferentes organosilanos de cadena corta utilizados en un segundo paso para cubrir los grupos silanol restantes ( capado de extremos ). Si bien el mecanismo de retención general sigue siendo el mismo, las sutiles diferencias en la química superficial de las distintas fases estacionarias darán lugar a cambios en la selectividad.

Las columnas modernas tienen diferente polaridad dependiendo del ligando unido a la fase estacionaria. PFP es pentafluorofenilo. CN es ciano. NH2 es amino. ODS es octadecilo o C18. ODCN es una columna de modo mixto que consta de C18 y nitrilo. [ 20 ]

fases móviles

Una fase móvil en RP-LC consiste en mezclas de agua o tampones acuosos, a los que se añaden disolventes adicionales, para eluir los analitos de una columna de fase inversa de manera selectiva. [ 8 ] [ 21 ] Los disolventes añadidos deben ser miscibles con el agua. Estos también se denominan "modificadores", ya que modifican la polaridad de la fase móvil. El agua es el disolvente más polar en la fase móvil de fase inversa. Para aumentar la fuerza de elución de la fase móvil, se suelen añadir modificadores para disminuir su polaridad. Los modificadores comunes incluyen acetonitrilo (ACN), metanol (MeOH), 2-propanol (isopropanol, IPA), etanol (EtOH) y tetrahidrofurano (THF).

Viscosidad

Si el evolante tiene una viscosidad alta, generará una contrapresión elevada . Por consiguiente, se prefieren los evolantes de baja viscosidad.

El IPA eluye con fuerza, pero también es muy viscoso, lo que genera altas contrapresiones. El ACN y el MeOH son menos viscosos que el IPA, aunque una mezcla de MeOH y agua al 50 % también es muy viscosa. En general, a medida que la proporción de disolvente orgánico y agua aumenta de 0:1 a 1:0, la viscosidad aumenta y luego disminuye.

En general, la contrapresión aumenta cuando se incrementa el caudal, se reduce la temperatura de la fase móvil o se aumenta el tamaño de las partículas de la fase estacionaria.

Absorbancia

Cuando se detectan componentes ópticamente, la fase móvil debe tener una alta transmitancia a la longitud de onda que utiliza el detector. La mayoría de los disolventes son más transparentes a longitudes de onda más largas. Por consiguiente, los investigadores suelen hablar de "longitudes de onda de corte" de los disolventes. La longitud de onda de corte de un disolvente es aquella a la que su absorbancia es igual a 1 UA . Solo se debe utilizar un modificador con luz por encima de la longitud de onda de corte.

Valores comúnmente utilizados: ACN 190 nm, acetona 330 nm, dietilamina 275 nm, EtOH 210 nm, IPA 205 nm, éter isopropílico 220 nm, MeOH 205 nm, 1-propanol 210 nm, THF 230 nm. [ 22 ] La mayoría de los péptidos solo absorben en longitudes de onda bajas en el espectro ultravioleta (típicamente menos de 225 nm) y, en consecuencia, para RP-LC con péptidos, el modificador más comúnmente utilizado es ACN.

Amortiguación del pH

El pH de la fase móvil puede modificar la retención y la selectividad de los analitos. [ 23 ] [ 24 ] Para muestras que contienen solutos con grupos funcionales ionizados, como aminas , carboxilos , fosfatos , fosfonatos , sulfatos y sulfonatos , la ionización de estos grupos puede controlarse ajustando el pH de la fase móvil. El pH de la fase móvil puede controlarse mediante tampones de fase móvil . [ 25 ]

En general, las moléculas con grupos funcionales ácidos se ionizan cada vez más en entornos más alcalinos, por lo que su tiempo de retención disminuye. Por el contrario, en entornos más ácidos, su tiempo de retención aumenta. Lo contrario ocurre con las moléculas con grupos funcionales alcalinos. [ 26 ]

Por ejemplo, los grupos carboxílicos en los solutos se cargan cada vez más negativamente a medida que el pH de la fase móvil supera su pKa; por lo tanto, la molécula completa se vuelve más polar y se retiene menos en la fase estacionaria apolar. En este caso, elevar el pH de la fase móvil por encima de 4–5 (que es el rango típico de pKa para los grupos carboxílicos) aumenta su ionización y, por consiguiente, disminuye su retención. De manera similar, las moléculas con grupos amina suelen tener un pKa cercano a 8. Sin embargo, dado que el gel de sílice no es estable en ambientes alcalinos, la fase móvil normalmente no tiene un pH superior a 8. Por lo tanto, el control sobre la retención de aminas es limitado cuando la fase estacionaria se basa en gel de sílice. [ 27 ]

La elección del tipo de tampón es un factor importante en el desarrollo de métodos de RP-LC, ya que puede afectar la retención, la selectividad y la resolución de los analitos de interés. [ 28 ] Existen muchos tampones utilizados en RP-HPLC, incluidos fosfato, acetato, formiato y amonio.

  • Un tampón amortigua de forma más eficaz en torno a su valor de pKa, por lo que el pKa del tampón debe estar cerca del pH deseado de la fase móvil.
  • El tampón debe ser compatible con el disolvente que se utiliza en la fase móvil, principalmente con los disolventes orgánicos comunes mencionados anteriormente: acetonitrilo, metanol e isopropanol.
  • Si se utiliza espectroscopia de absorción UV para la detección, el tampón debe tener una baja absorción en la longitud de onda elegida.
  • Si se utiliza espectrometría de masas (EM) para la detección, el tampón debe ser compatible con el instrumento EM. Algunos tampones, como los que contienen sales de fosfato, no se pueden usar con los detectores EM, ya que no son volátiles y suprimen la ionización de los analitos, lo que hace que no sean detectados por EM. [ 29 ]

Los analitos cargados también pueden separarse mediante cromatografía de fase inversa por interacción iónica . [ 30 ]

Véase también

Referencias

  1. ↑ IUPAC , Compendio de Terminología Química , 5.ª ed. (el "Libro de Oro") (2025). Versión en línea: (2006 – ) " cromatografía de fase inversa ". doi : 10.1351/goldbook.R05376
  2. ↑ Žuvela, Petar; Skoczylas, Magdalena; Jay Liu, J.; Ba̧Czek, Tomasz; Kaliszan, Roman; Wong, Ming Wah; Buszewski, Bogusław; Héberger, K. (2019). "Caracterización de columnas y sistemas de selección en cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa". Chemical Reviews . 119 (6): 3674– 3729. doi : 10.1021/acs.chemrev.8b00246 . PMID 30604951 . S2CID 58631771 .  
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  • Tablas que resumen los diferentes tipos de fases inversas e información sobre el proceso de funcionalización.