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reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa

RT-PCR La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa ( RT-PCR ) es una técnica de laboratorio que combina la transcripción inversa del ARN a ADN (en este cont...

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RT-PCR

La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa ( RT-PCR ) es una técnica de laboratorio que combina la transcripción inversa del ARN a ADN (en este contexto, ADN complementario o ADNc) y la amplificación de secuencias de ADN específicas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [ 1 ] Se utiliza principalmente para medir la cantidad de un ARN específico. Esto se logra monitorizando la reacción de amplificación mediante fluorescencia, una técnica denominada PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR). La combinación de RT-PCR y qPCR se utiliza habitualmente para el análisis de la expresión génica y la cuantificación del ARN viral en entornos clínicos y de investigación.

La estrecha relación entre RT-PCR y qPCR ha llevado al uso metonímico del término qPCR para referirse a RT-PCR. Este uso puede resultar confuso, [ 2 ] ya que la RT-PCR puede utilizarse sin qPCR, por ejemplo, para permitir la clonación molecular , la secuenciación o la detección simple de ARN. A la inversa, la qPCR puede utilizarse sin RT-PCR, por ejemplo, para cuantificar el número de copias de un fragmento específico de ADN.

Nomenclatura

La técnica combinada de RT-PCR y qPCR se ha descrito como RT-PCR cuantitativa [ 3 ] o RT-PCR en tiempo real [ 4 ] (a veces incluso llamada RT-PCR cuantitativa en tiempo real [ 5 ] ), y se ha abreviado de diversas maneras como qRT-PCR [ 6 ] , RT-qPCR [ 7 ] , RRT-PCR [ 8 ] y rRT-PCR [ 9 ] . Para evitar confusiones, se utilizarán las siguientes abreviaturas de forma consistente a lo largo de este artículo:

No todos los autores, especialmente los más antiguos, utilizan esta convención, por lo que el lector debe tener precaución al seguir los enlaces. RT-PCR se ha utilizado para referirse tanto a la PCR en tiempo real (qPCR) como a la PCR de transcripción inversa (RT-PCR).

Historia

Desde su introducción en 1977, la transferencia Northern se ha utilizado ampliamente para la cuantificación de ARN a pesar de sus limitaciones: (a) es una técnica que consume mucho tiempo, (b) requiere una gran cantidad de ARN para su detección y (c) es cuantitativamente imprecisa en presencia de ARN de baja abundancia. [ 10 ] [ 11 ] Sin embargo, desde que Kary Mullis inventó la PCR en 1983, la RT-PCR ha desplazado a la transferencia Northern como el método de elección para la detección y cuantificación de ARN. [ 12 ]

La RT-PCR se ha convertido en la tecnología de referencia para la detección y/o comparación de niveles de ARN por varias razones: (a) no requiere procesamiento posterior a la PCR, (b) se puede medir un amplio rango (>10⁷ veces ) de abundancia de ARN, y (c) proporciona información tanto cualitativa como cuantitativa. [ 5 ] Debido a su simplicidad, especificidad y sensibilidad, la RT-PCR se utiliza en una amplia gama de aplicaciones , desde experimentos tan simples como la cuantificación de células de levadura en vino hasta usos más complejos como herramientas de diagnóstico para detectar agentes infecciosos como el virus de la gripe aviar y el SARS-CoV-2 . [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]

Principios

En la RT-PCR, la plantilla de ARN se convierte primero en ADN complementario (ADNc) mediante una transcriptasa inversa (RT). El ADNc se utiliza posteriormente como plantilla para la amplificación exponencial mediante PCR. El uso de la RT-PCR para la detección de transcritos de ARN ha revolucionado el estudio de la expresión génica de las siguientes maneras importantes:

  • Hizo posible, en teoría, detectar las transcripciones de prácticamente cualquier gen [ 16 ].
  • Permitió la amplificación de muestras y eliminó la necesidad de abundante material de partida requerido al utilizar el análisis de Northern blot [ 17 ] [ 18 ]
  • Proporciona tolerancia a la degradación del ARN siempre que el ARN que abarca el cebador esté intacto [ 17 ].

RT-PCR de un paso frente a RT-PCR de dos pasos

RT-PCR de un paso frente a RT-PCR de dos pasos

La cuantificación de ARNm mediante RT-PCR puede realizarse como una reacción de un paso o de dos pasos. La diferencia entre ambos enfoques radica en el número de tubos utilizados durante el procedimiento. La reacción de dos pasos requiere que la reacción de transcriptasa inversa y la amplificación por PCR se realicen en tubos separados. La desventaja del enfoque de dos pasos es la susceptibilidad a la contaminación debido a la manipulación más frecuente de la muestra. [ 19 ] Por otro lado, en el enfoque de un paso, toda la reacción, desde la síntesis de ADNc hasta la amplificación por PCR, se lleva a cabo en un solo tubo. Se cree que el enfoque de un paso minimiza la variación experimental al contener todas las reacciones enzimáticas en un solo entorno. Elimina los pasos de pipeteo del producto de ADNc, que es laborioso y propenso a la contaminación, para la reacción de PCR. El uso adicional de ADN polimerasas termoestables tolerantes a inhibidores , potenciadores de polimerasa con una condición de RT-PCR de un paso optimizada, permite la transcripción inversa del ARN a partir de muestras sin purificar o crudas, como sangre entera y suero . [ 20 ] [ 21 ] Sin embargo, las plantillas de ARN iniciales son propensas a la degradación en el método de un solo paso, y no se recomienda el uso de este método cuando se requieren ensayos repetidos de la misma muestra. Además, se informa que el método de un solo paso es menos preciso en comparación con el método de dos pasos. También es el método de análisis preferido cuando se utilizan colorantes de unión al ADN como SYBR Green, ya que la eliminación de dímeros de cebadores se puede lograr mediante un simple cambio en la temperatura de fusión . No obstante, el método de un solo paso es una solución relativamente conveniente para la detección rápida de ARN objetivo directamente en biosensores.

RT-PCR de punto final frente a RT-PCR en tiempo real

La cuantificación de los productos de RT-PCR se puede dividir en dos categorías principales: punto final y tiempo real. [ 22 ] Se prefiere el uso de RT-PCR de punto final para medir cambios en la expresión génica en un número reducido de muestras, pero la RT-PCR en tiempo real se ha convertido en el método de referencia para validar los resultados cuantitativos obtenidos a partir de análisis de microarrays o cambios en la expresión génica a escala global. [ 23 ]

RT-PCR de punto final

Los métodos de medición de la RT-PCR de punto final requieren la detección de los niveles de expresión génica mediante el uso de colorantes fluorescentes como el bromuro de etidio , [ 24 ] [ 25 ] el marcaje de productos de PCR con P32 mediante un fosforimager , [ 26 ] o mediante recuento por centelleo . [ 18 ] La RT-PCR de punto final se realiza comúnmente mediante tres métodos diferentes: relativo, competitivo y comparativo. [ 27 ] [ 28 ]

RT-PCR relativa
La cuantificación relativa de RT-PCR implica la coamplificación de un control interno simultáneamente con el gen de interés. El control interno se utiliza para normalizar las muestras. Una vez normalizadas, se puede realizar una comparación directa de la abundancia relativa de transcritos entre múltiples muestras de ARNm. Es importante tener en cuenta que el control interno debe elegirse de manera que no se vea afectado por el tratamiento experimental. El nivel de expresión debe ser constante en todas las muestras y con el ARNm de interés para que los resultados sean precisos y significativos. Dado que la cuantificación de los resultados se analiza comparando el rango lineal de la amplificación del gen diana y del control, es crucial considerar la concentración inicial de las moléculas diana y su tasa de amplificación antes de comenzar el análisis. Los resultados del análisis se expresan como la relación entre la señal del gen y la señal del control interno, valores que luego se pueden utilizar para la comparación entre las muestras en la estimación de la expresión relativa del ARN diana. [ 25 ] [ 28 ] [ 29 ]
RT-PCR competitiva
La técnica de RT-PCR competitiva se utiliza para la cuantificación absoluta. Consiste en el uso de un ARN sintético "competidor" que se distingue del ARN diana por una pequeña diferencia de tamaño o secuencia. Para obtener resultados precisos, es importante que el ARN sintético tenga una secuencia idéntica, pero ligeramente más corta que el ARN diana. Una vez diseñado y sintetizado, se añade una cantidad conocida de ARN competidor a las muestras experimentales y se coamplifica con la diana mediante RT-PCR. A continuación, se genera una curva de concentración del ARN competidor, que se utiliza para comparar las señales de RT-PCR producidas por los transcritos endógenos y determinar la cantidad de diana presente en la muestra. [ 28 ] [ 30 ]
RT-PCR comparativa
La RT-PCR comparativa es similar a la RT-PCR competitiva en que el ARN diana compite por los reactivos de amplificación dentro de una misma reacción con un estándar interno de secuencia no relacionada. Una vez completada la reacción, los resultados se comparan con una curva estándar externa para determinar la concentración del ARN diana. En comparación con los métodos de cuantificación relativa y competitiva, la RT-PCR comparativa se considera el método más conveniente, ya que no requiere que el investigador realice un experimento piloto; en la RT-PCR relativa, se debe predeterminar el rango de amplificación exponencial del ARNm y en la RT-PCR competitiva, se debe sintetizar un ARN competidor sintético. [ 28 ] [ 31 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]

RT-PCR en tiempo real

La aparición de nuevas técnicas de marcaje fluorescente de ADN en los últimos años ha permitido el análisis y la detección de productos de PCR en tiempo real y, en consecuencia, ha llevado a la adopción generalizada de la RT-PCR en tiempo real para el análisis de la expresión génica. [ 35 ] La RT-PCR en tiempo real no solo es ahora el método de elección para la cuantificación de la expresión génica, sino que también es el método preferido para obtener resultados de análisis de matrices y expresiones génicas a escala global. [ 36 ] Actualmente, hay cuatro sondas de ADN fluorescentes diferentes disponibles para la detección de productos de PCR mediante RT-PCR en tiempo real: SYBR Green , TaqMan , sondas moleculares y sondas Scorpion . Todas estas sondas permiten la detección de productos de PCR mediante la generación de una señal fluorescente. Mientras que el colorante SYBR Green emite su señal fluorescente simplemente al unirse al ADN de doble cadena en solución, la generación de fluorescencia de las sondas TaqMan, los balizas moleculares y los escorpiones depende del acoplamiento por transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) de la molécula del colorante y una porción extintora a los sustratos de oligonucleótidos. [ 37 ]

SYBR Verde
Cuando el SYBR Green se une al ADN de doble cadena de los productos de PCR, emite luz al ser excitado. La intensidad de la fluorescencia aumenta a medida que se acumulan los productos de PCR. Esta técnica es fácil de usar, ya que no es necesario diseñar sondas debido a la falta de especificidad de su unión. Sin embargo, dado que el colorante no distingue entre el ADN de doble cadena de los productos de PCR y el de los dímeros de cebadores, la sobreestimación de la concentración del objetivo es un problema común. Cuando la cuantificación precisa es absolutamente necesaria, se deben realizar ensayos adicionales para la validación de los resultados. No obstante, entre los métodos de detección de productos de RT-PCR en tiempo real, el SYBR Green es el más económico y fácil de usar. [ 22 ] [ 23 ]
Sondas Taqman
Sondas TaqMan
Las sondas TaqMan son oligonucleótidos que tienen una sonda fluorescente unida al extremo 5' y un extintor al extremo 3'. Durante la amplificación por PCR, estas sondas se hibridan con las secuencias diana ubicadas en el amplicón y, a medida que la polimerasa replica el molde con la sonda TaqMan unida, también escinde la sonda fluorescente debido a la actividad nucleasa 5' de la polimerasa. Debido a que la proximidad entre la molécula extintora y la sonda fluorescente normalmente impide que la fluorescencia se detecte mediante FRET, el desacoplamiento produce un aumento de la intensidad de la fluorescencia proporcional al número de ciclos de escisión de la sonda. Aunque las sondas TaqMan bien diseñadas producen resultados precisos de RT-PCR en tiempo real, su síntesis es costosa y requiere mucho tiempo cuando se deben crear sondas separadas para cada ARNm diana analizado. [ 22 ] [ 16 ] [ 38 ] Además, estas sondas son sensibles a la luz y deben congelarse cuidadosamente en alícuotas para evitar su degradación.
Sondas de baliza molecular
Al igual que las sondas TaqMan, las sondas moleculares tipo baliza también utilizan la detección FRET con sondas fluorescentes unidas al extremo 5' y un extintor unido al extremo 3' de un sustrato de oligonucleótido. Sin embargo, mientras que las sondas fluorescentes TaqMan se escinden durante la amplificación, las sondas moleculares tipo baliza permanecen intactas y se unen a una nueva diana durante cada ciclo de reacción. Cuando están libres en solución, la proximidad entre la sonda fluorescente y la molécula extintora impide la fluorescencia por FRET. Sin embargo, cuando las sondas moleculares tipo baliza se hibridan con una diana, el colorante fluorescente y el extintor se separan, lo que resulta en la emisión de luz al ser excitadas. Al igual que las sondas TaqMan, las sondas moleculares tipo baliza son costosas de sintetizar y requieren sondas separadas para cada diana de ARN. [ 19 ]
Sondas de escorpión
Las sondas Scorpion, al igual que las balizas moleculares, no presentan fluorescencia en estado no hibridado, debido a que la sonda fluorescente del extremo 5' se ve inactivada por la porción del extremo 3' del oligonucleótido. Sin embargo, en el caso de las sondas Scorpion, el extremo 3' también contiene una secuencia complementaria al producto de extensión del cebador del extremo 5'. Cuando la extensión de la sonda Scorpion se une a su complemento en el amplicón, la estructura de la sonda se abre, lo que impide la transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) y permite medir la señal fluorescente. [ 39 ]
Sondas multiplex
Las sondas TaqMan, los marcadores moleculares y los escorpiones permiten la medición simultánea de productos de PCR en un solo tubo. Esto es posible porque cada uno de los diferentes colorantes fluorescentes puede asociarse con un espectro de emisión específico. El uso de sondas multiplex no solo ahorra tiempo y esfuerzo sin comprometer la utilidad de la prueba, sino que su aplicación en amplias áreas de investigación, como el análisis de deleción génica, el análisis de mutaciones y polimorfismos, el análisis cuantitativo y la detección de ARN, la convierte en una técnica invaluable para laboratorios de diversas disciplinas. [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ]

Para cuantificar los resultados obtenidos mediante RT-PCR en tiempo real se suelen emplear dos estrategias: el método de la curva estándar y el método del umbral comparativo. [ 42 ]

Solicitud

La amplificación exponencial mediante reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa proporciona una técnica altamente sensible que permite detectar incluso un número muy bajo de copias de moléculas de ARN. La RT-PCR se utiliza ampliamente en el diagnóstico de enfermedades genéticas y, de forma semicuantitativa, en la determinación de la abundancia de moléculas de ARN específicas dentro de una célula o tejido como medida de la expresión génica .

Métodos de investigación

La RT-PCR se utiliza comúnmente en métodos de investigación para medir la expresión génica. Por ejemplo, Lin et al. utilizaron qRT-PCR para medir la expresión de genes Gal en células de levadura. Primero, Lin et al. diseñaron una mutación de una proteína que se sospechaba participaba en la regulación de los genes Gal. Se hipotetizó que esta mutación aboliría selectivamente la expresión de Gal. Para confirmar esto, se analizaron los niveles de expresión génica de células de levadura que contenían esta mutación utilizando qRT-PCR. Los investigadores pudieron determinar de manera concluyente que la mutación de esta proteína reguladora redujo la expresión de Gal. [ 43 ] El análisis Northern blot se utiliza para estudiar más a fondo la expresión génica del ARN.

Inserción de genes

La RT-PCR también puede ser muy útil para la inserción de genes eucariotas en procariotas . Dado que la mayoría de los genes eucariotas contienen intrones , presentes en el genoma pero no en el ARNm maduro, el ADNc generado a partir de una reacción de RT-PCR es la secuencia de ADN exacta (sin tener en cuenta la naturaleza propensa a errores de las transcriptasas inversas) que se traduciría directamente en proteína tras la transcripción . Cuando estos genes se expresan en células procariotas para la producción o purificación de proteínas, el ARN producido directamente por transcripción no necesita ser empalmado, ya que el transcrito contiene solo exones . (Los procariotas, como E. coli, carecen del mecanismo de empalme de ARNm de los eucariotas).

diagnóstico de enfermedades genéticas

La RT-PCR puede utilizarse para diagnosticar enfermedades genéticas como el síndrome de Lesch-Nyhan . Esta enfermedad genética es causada por una disfunción en el gen HPRT1 , que clínicamente produce cálculos urinarios de ácido úrico fatales y síntomas similares a la gota . [6] El análisis de los niveles de expresión de ARNm de HPRT1 en una madre embarazada y un feto revelará si la madre es portadora y si el feto tiene probabilidades de desarrollar el síndrome de Lesch-Nyhan. [ 44 ]

Detección del cáncer

Los científicos están trabajando en formas de utilizar la RT-PCR en la detección del cáncer para ayudar a mejorar el pronóstico y monitorizar la respuesta a la terapia. Las células tumorales circulantes producen transcripciones de ARNm únicas según el tipo de cáncer. El objetivo es determinar qué transcripciones de ARNm sirven como los mejores biomarcadores para un tipo particular de célula cancerosa y luego analizar sus niveles de expresión con RT-PCR. [ 45 ]

La RT-PCR se utiliza comúnmente para estudiar los genomas de virus cuyos genomas están compuestos de ARN, como el virus de la influenza A , retrovirus como el VIH y el SARS-CoV-2 . [ 46 ]

Detección de patógenos

Las pruebas de PCR se pueden utilizar para la detección temprana de patógenos basados ​​en ADN mediante la amplificación del ADN de un patógeno, incluso antes de que el huésped comience a producir anticuerpos . [ 47 ] La RT-PCR permite aplicar este proceso a los virus de ARN . [ 36 ] Las pruebas de RT-PCR son más conocidas por su uso en las pruebas de COVID-19 [ 48 ] pero también se han utilizado para diagnosticar enfermedades como el Ébola , el Zika , el MERS , el SARS y la gripe . [ 36 ] [ 48 ]

Desafíos

A pesar de sus grandes ventajas, la RT-PCR no está exenta de inconvenientes. El crecimiento exponencial del ADN complementario (ADNc) retrotranscrito durante los múltiples ciclos de PCR produce una cuantificación final inexacta debido a la dificultad para mantener la linealidad. [ 49 ] Para proporcionar una detección y cuantificación precisas del contenido de ARN en una muestra, se desarrolló la qRT-PCR utilizando una modificación basada en fluorescencia para monitorear los productos de amplificación durante cada ciclo de PCR. La extrema sensibilidad de la técnica puede ser un arma de doble filo, ya que incluso la más mínima contaminación de ADN puede conducir a resultados indeseables. [ 50 ] Un método simple para eliminar los resultados falsos positivos es incluir anclas, o etiquetas , en la región 5' de un cebador específico del gen. [ 51 ] Además, la planificación y el diseño de estudios de cuantificación pueden ser técnicamente desafiantes debido a la existencia de numerosas fuentes de variación, incluyendo la concentración de la plantilla y la eficiencia de amplificación. [ 31 ] Se puede utilizar como control la adición de una cantidad conocida de ARN a una muestra, la adición de una serie de diluciones de ARN que generan una curva estándar y la adición de una muestra sin copia de plantilla (sin ADNc).

Protocolo

La RT-PCR se puede realizar mediante el protocolo de RT-PCR de un paso o el protocolo de RT-PCR de dos pasos.

RT-PCR de un solo paso

La RT-PCR de un solo paso somete las secuencias de ARNm diana (hasta 6 kb) a transcripción inversa, seguida de amplificación por PCR en un único tubo de ensayo. El uso de ARN intacto de alta calidad y un cebador específico de secuencia proporcionará los mejores resultados.

Una vez seleccionado un kit de RT-PCR de un solo paso con una mezcla de transcriptasa inversa, ADN polimerasa Taq y una polimerasa correctora, y obtenidos todos los materiales y equipos necesarios, se prepara una mezcla de reacción. Esta mezcla incluye dNTPs, cebadores, ARN molde, enzimas necesarias y una solución tampón . La mezcla de reacción se añade a un tubo de PCR para cada reacción, seguida del ARN molde. A continuación, los tubos de PCR se colocan en un termociclador para iniciar el ciclo. En el primer ciclo, se produce la síntesis de ADNc. El segundo ciclo es la desnaturalización inicial, en la que se inactiva la transcriptasa inversa. Los 40-50 ciclos restantes corresponden a la amplificación, que incluye desnaturalización, hibridación y elongación. Una vez completada la amplificación, los productos de la RT-PCR pueden analizarse mediante electroforesis en gel . [ 52 ] [ 53 ]

RT-PCR de dos pasos

La RT-PCR de dos pasos, como su nombre indica, se realiza en dos etapas: primero la transcripción inversa y luego la PCR. Este método es más sensible que el de un solo paso. También existen kits para la RT-PCR de dos pasos. Al igual que con la PCR de un solo paso, para obtener los mejores resultados, utilice únicamente ARN intacto y de alta calidad. El cebador para la PCR de dos pasos no tiene por qué ser específico de secuencia.

Paso uno

Primero, combine el ARN molde, el cebador, la mezcla de dNTP y agua libre de nucleasas en un tubo de PCR. Luego, agregue un inhibidor de RNasa y la transcriptasa inversa al tubo. A continuación, coloque el tubo en un termociclador durante un ciclo, en el cual se produce la hibridación, la extensión y la inactivación de la transcriptasa inversa. Finalmente, proceda directamente al paso dos, que es la PCR, o conserve el producto en hielo hasta que pueda realizarse la PCR.

Paso dos

Agregue la mezcla maestra, que contiene tampón, mezcla de dNTP, MgCl₂ , polimerasa Taq y agua libre de nucleasas, a cada tubo de PCR. Luego, agregue el cebador necesario a los tubos. A continuación, coloque los tubos de PCR en un termociclador durante 30 ciclos del programa de amplificación. Esto incluye desnaturalización, hibridación y elongación. Los productos de la RT-PCR se pueden analizar mediante electroforesis en gel. [ 54 ]

Directrices de publicación

El ensayo de RT-PCR cuantitativa se considera el método de referencia para medir el número de copias de secuencias de ADNc específicas en una muestra, pero su estandarización es deficiente. [ 55 ] Como resultado, si bien existen numerosas publicaciones que utilizan esta técnica, muchas proporcionan detalles experimentales inadecuados y emplean análisis de datos inapropiados para llegar a conclusiones erróneas. Debido a la variabilidad inherente en la calidad de los datos de PCR cuantitativa, no solo los revisores tienen dificultades para evaluar estos manuscritos, sino que los estudios también se vuelven imposibles de replicar. [ 56 ] Reconociendo la necesidad de estandarizar la descripción de las condiciones experimentales, un consorcio internacional de científicos académicos, entre los que se incluyen los profesores Stephen Bustin , Michael Pfaffl y Mikael Kubista , publicó las directrices de Información Mínima para la Publicación de Experimentos de PCR Cuantitativa en Tiempo Real ( MIQE , pronunciado "mykee") . Las directrices MIQE describen la información mínima necesaria para evaluar los experimentos de PCR cuantitativa que debería exigirse para su publicación, con el fin de fomentar mejores prácticas experimentales y garantizar la relevancia, la precisión, la correcta interpretación y la repetibilidad de los datos de PCR cuantitativa. [ 57 ]

Además de las directrices de notificación, el MIQE subraya la necesidad de estandarizar la nomenclatura asociada a la PCR cuantitativa para evitar confusiones; por ejemplo, la abreviatura qPCR debe utilizarse para la PCR cuantitativa en tiempo real , mientras que RT-qPCR debe utilizarse para la PCR cuantitativa con transcripción inversa, y los genes utilizados para la normalización deben denominarse genes de referencia en lugar de genes de mantenimiento . También propone que no se utilicen términos derivados comercialmente como sondas TaqMan , sino que se denominen sondas de hidrólisis . Adicionalmente, se propone que el ciclo de cuantificación (Cq) se utilice para describir el ciclo de PCR utilizado para la cuantificación en lugar del ciclo umbral (Ct), el punto de cruce (Cp) y el punto de inicio (TOP), que se refieren al mismo valor pero fueron acuñados por diferentes fabricantes de instrumentos en tiempo real . [ 55 ]

La guía consta de los siguientes elementos: 1) diseño experimental, 2) muestra, 3) extracción de ácidos nucleicos , 4) transcripción inversa, 5) información del objetivo de qPCR, 6) oligonucleótidos, 7) protocolo, 8) validación y 9) análisis de datos. Los elementos específicos dentro de cada categoría llevan la etiqueta E (esencial) o D (deseable). Los etiquetados con E se consideran críticos e indispensables, mientras que los etiquetados con D se consideran periféricos, pero importantes para las buenas prácticas. [ 57 ]

El profesor Michael Pfaffl de la Universidad Técnica de Múnich, el profesor Mikael Kubista del Instituto de Biotecnología de la Academia Checa de Ciencias , el profesor Vladimir Benes del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EMBL) en Heidelberg y el profesor Stephen Bustin de la Universidad Anglia Ruskin de Londres organizan periódicamente conferencias y cursos sobre RT-qPCR y el uso de las directrices MIQE. Juntos, apoyan la formación en Precision BioAnalytics en GoCo Health Innovation City en Gotemburgo, Suecia, tras la interrupción de los cursos en TATAA Biocenter después de que Care Equity se hiciera cargo de la organización.

Investigación

En 2023, investigadores desarrollaron un prototipo funcional de un sistema de laboratorio en un chip RT-LAMP , que proporcionaba resultados para las pruebas de SARS-CoV-2 en tres minutos. Esta tecnología integra canales microfluídicos en placas de circuitos impresos, lo que podría permitir la producción en masa a bajo costo. [ 58 ] [ 59 ]

Referencias

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  • Animación para ilustrar el procedimiento de RT-PCR, del Laboratorio Cold Spring Harbor.
  • La referencia en qPCR: una plataforma de información académica e industrial.
  • Los 5 mejores centros gubernamentales de RT-PCR en Mumbai (Archivado el 11/07/2021 en Wayback Machine)