MIQE

En 2009, Stephen Bustin lideró un grupo internacional de científicos, entre ellos los profesores Mikael Kubista y Michael Pfaffl, para elaborar un conjunto de directrices sobre cómo realizar la qPCR y qué tipos de datos debían recopilarse y publicarse durante el proceso. ^{[ 1 ]} Esto también permitió a los editores y revisores de revistas científicas utilizar las directrices al revisar un artículo enviado que incluyera datos de qPCR. De este modo, las directrices se establecieron como una especie de lista de verificación para cada paso del procedimiento, marcando ciertos elementos como esenciales (E) al enviar datos para su publicación y otros como deseables (D). ^{[ 4 ]}

En septiembre de 2010 se publicó una versión adicional de las directrices para su uso con PCR cuantitativa en tiempo real basada en fluorescencia. También sirvió como resumen de la versión más amplia de las directrices. ^{[ 5 ]} Otros investigadores han estado creando versiones adicionales para formas específicas de qPCR que pueden requerir un conjunto de elementos suplementarios o diferentes para verificar, incluyendo qPCR de célula única ^{[ 6 ]} y PCR digital (dPCR). ^{[ 7 ]} La adhesión adecuada a las directrices MIQE existentes también se ha revisado en otras áreas científicas, incluyendo la fotobiomodulación ^{[ 8 ]} y los biomarcadores clínicos . ^{[ 9 ]}

Bustin señaló en 2014 (y nuevamente en 2017) que existía cierta adopción y uso de las directrices MIQE dentro de la comunidad científica, pero aún había demasiados artículos publicados con experimentos de qPCR que carecían incluso de la presentación de datos más básica y la confirmación adecuada de la efectividad de dichos datos. Estos estudios presentaban importantes problemas de reproducibilidad, donde las conclusiones de su evidencia no podían ser replicadas por otros investigadores, lo que ponía en duda los resultados iniciales. Todo esto a pesar de que muchos artículos citaban directamente la publicación original de Bustin sobre MIQE, pero no seguían la lista de verificación de la guía de materiales en sus propios experimentos. ^{[ 2 ] [ 10 ]} Sin embargo, algunos investigadores han señalado al menos cierto éxito, con varios artículos rechazados por revistas académicas para su publicación debido a que no superaban las listas de verificación MIQE. Otros estudios han sido retractados posteriormente una vez que se detectó y señaló públicamente a los editores de las revistas la falta de datos adecuados para superar las directrices MIQE. ^{[ 11 ]}

Al configurar sus nuevos sistemas de qPCR comparativos denominados "Dots in Boxes" en 2017, New England Biolabs declaró que habían diseñado la parte de recolección de datos en función de las directrices MIQE para que los datos se ajustaran a todas las listas de verificación de parámetros mínimos en los protocolos. ^{[ 12 ]} Otras empresas de instrumentos científicos han ayudado al cumplimiento de las directrices adaptando específicamente sus dispositivos para ellas, incluyendo Bio-Rad creando una aplicación móvil que permite marcar activamente la lista de verificación MIQE a medida que se completa cada paso. ^{[ 13 ]}

En junio de 2020 se realizó una revisión del décimo aniversario de la publicación de las directrices MIQE, donde se analizaron los estudios científicos que habían producido resultados mejores y más organizados al seguir dichas directrices. ^{[ 14 ]} En agosto de 2020, se publicó una versión actualizada de las directrices para el método de PCR digital, que incorporaba mejoras en la maquinaria, las tecnologías y las técnicas desde la publicación original de 2013. Se añadieron pasos adicionales a las directrices para el análisis de datos, además de proporcionar una tabla de lista de verificación más simplificada para los investigadores. ^{[ 15 ]} En diciembre de 2020, Stephen Bustin desarrolló un ensayo de RT-qPCR dirigido, utilizando las directrices MIQE para biomarcadores clínicos, con el fin de identificar la presencia clínica de partículas virales de COVID-19 durante la pandemia . ^{[ 16 ]}

Gran parte de las directrices incluyen acciones básicas que normalmente se incluirían en experimentos y publicaciones, como la descripción de las diferencias entre el grupo experimental y el grupo de control. Otra información relevante es la cantidad de unidades individuales utilizadas en cada grupo del experimento. Estos dos aspectos se consideran esenciales para cualquier estudio. Esta sección también incluye dos puntos importantes: indicar si el ensayo de qPCR fue realizado por el propio laboratorio del autor o por un laboratorio central de la universidad u organización, y reconocer la contribución de otras personas al trabajo. ^{[ 1 ]}

Los requisitos esenciales que deben cumplir las muestras y el material de muestra incluyen una descripción de la muestra, la forma de disección utilizada, el método de procesamiento empleado, si las muestras se congelaron o fijaron y el tiempo que duró el proceso, así como las condiciones de la muestra. También es conveniente conocer el volumen o la masa de la muestra procesada para la qPCR. ^{[ 1 ]}

Para el proceso de extracción de ADN/ARN, existen varias directrices esenciales. Estas incluyen una descripción del proceso de extracción realizado, una declaración sobre el kit de extracción de ADN utilizado y cualquier modificación realizada a las instrucciones, detalles sobre si se utilizó algún tratamiento con DNasa o RNasa , una declaración sobre si se evaluó alguna contaminación, una cuantificación de la cantidad de material genético extraído, una descripción de los instrumentos utilizados para la extracción, los métodos utilizados para mantener la integridad del ARN, una declaración sobre el número de integridad del ARN y el indicador de calidad y el ciclo de cuantificación (Cq) alcanzado, y finalmente, qué pruebas se realizaron para determinar la presencia o ausencia de inhibidores . Cuatro datos deseados son la procedencia de los reactivos utilizados, el nivel de pureza genética obtenido, el rendimiento obtenido y una imagen del gel de electroforesis para su confirmación. ^{[ 1 ]}

Las partes esenciales de esta fase incluyen detallar completamente las condiciones de reacción, indicando tanto la cantidad de ARN utilizada como el volumen total de la reacción, proporcionar información sobre el oligonucleótido utilizado como cebador y su concentración, la concentración y el tipo de transcriptasa inversa utilizada, y finalmente la temperatura y el tiempo de reacción. También es conveniente incluir los números de catálogo de los reactivos utilizados y sus fabricantes, la desviación estándar del Cq con y sin la transcriptasa, y cómo se almacenó el ADNc . ^{[ 1 ]}

Aquí es necesaria toda la información básica sobre el objetivo, incluyendo el símbolo del gen, el número de acceso a la base de datos de la secuencia en cuestión, la longitud de la secuencia que se está amplificando, información sobre la prueba de especificidad utilizada, como BLAST , qué variantes de empalme existen para la secuencia y dónde se encuentra el exón o intrón para cada cebador. Hay varios datos deseables, pero no obligatorios, para esta sección, como la ubicación del amplicón , si existen pseudogenes u homólogos , si se realizó un alineamiento de secuencias y los datos obtenidos de él, y cualquier dato sobre la estructura secundaria de la secuencia amplificada. ^{[ 1 ]}

La creación de los oligonucleótidos requiere solo dos datos esenciales: las secuencias de los cebadores utilizados y la ubicación y los detalles de cualquier modificación realizada en la secuencia. Sin embargo, existen varios datos deseables, como el número de identificación de la base de datos RTPrimerDB, las secuencias de las sondas , el fabricante de los oligonucleótidos y el método de purificación. ^{[ 1 ]}

Como uno de los segmentos principales de las directrices, la lista de verificación para el proceso de qPCR incluye varios puntos esenciales. Esto abarca el conjunto completo de condiciones utilizadas para la reacción, el volumen de la reacción y del ADNc, las concentraciones de las sondas, los iones de magnesio y los dNTP , el tipo de polimerasa utilizada y su concentración, el kit utilizado y su fabricante, los aditivos utilizados en la reacción, el fabricante del termociclador y los parámetros establecidos para el proceso de termociclado . La única información adicional deseada es la composición química del tampón utilizado, el fabricante de las placas y los tubos utilizados y su número de catálogo, y si la reacción se preparó manualmente o mediante un termociclador. ^{[ 1 ] [ 17 ]}

Para confirmar la efectividad y calidad del proceso de qPCR realizado, se deben presentar varias acciones y datos posteriores. Esto incluye explicar el método específico de verificación del funcionamiento del proceso, como el uso de gel, la secuenciación directa del material genético, la visualización de un perfil de fusión o la digestión con enzimas de restricción . Si se utilizó SYBR Green I , se debe indicar el valor de Cq del grupo control sin ADN molde. ^{[ 1 ]}

Otros datos esenciales incluyen la calibración de las curvas de la máquina con la pendiente y la intersección con el eje y anotadas, la eficiencia del proceso de PCR determinada a partir de la pendiente mencionada, los coeficientes de correlación (r cuadrado) para las curvas de calibración, el rango dinámico de las curvas lineales, el Cq encontrado en la concentración más baja donde el 95% de los resultados aún eran positivos ( LOD ) junto con la evidencia del LOD mismo, y finalmente, si se utiliza un multiplex , entonces la eficiencia y el LOD deben proporcionarse para cada ensayo realizado. ^{[ 1 ] [ 17 ]} Como complemento a la determinación del LOD, también se debe determinar el límite de cuantificación (LOQ) para los ensayos de diagnóstico siguiendo la norma ISO y para el desarrollo de fármacos siguiendo las recomendaciones del documento técnico de la AAPS de Hays et al. ^{[ 18 ]} Estos cálculos se basan en el análisis de réplicas en una curva estándar. ^{[ 19 ]}

La información adicional deseada incluye evidencia de que la optimización de qPCR se produjo mediante el uso de gradientes, los intervalos de confianza para mostrar la eficiencia de la qPCR y los intervalos de confianza para todo el rango probado. ^{[ 1 ]}

La sección final de las directrices incluye información sobre cómo se realizó el análisis de los datos de qPCR. Los aspectos esenciales incluyen el programa y la versión del programa utilizados para el análisis, el método para determinar el Cq, la identificación de los valores atípicos en los datos y cómo se utilizan o excluyen y por qué, los resultados obtenidos para los controles sin material genético molde, una explicación de por qué se eligieron los genes de referencia utilizados y por qué se eligió su número, el método utilizado para normalizar los datos, cuántas réplicas técnicas se incluyeron, qué tan repetibles fueron los datos dentro de los ensayos, qué métodos se utilizaron para determinar la significancia de los resultados y qué software se utilizó para esta parte del análisis cualitativo. ^{[ 1 ]}

También se desea incluir información sobre el número de réplicas biológicas y si coincidieron con los resultados de las réplicas técnicas, los datos de reproducibilidad para las variantes de concentración, datos sobre el análisis de potencia y, por último, que los investigadores envíen los datos brutos en formato de archivo RDML. ^{[ 1 ] [ 20 ]}