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replicación de círculo rodante

La replicación en círculo rodante produce múltiples copias de una única plantilla circular. La replicación en círculo rodante ( RCR ) es un proceso de replicación unidireccional...

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La replicación en círculo rodante produce múltiples copias de una única plantilla circular.

La replicación en círculo rodante ( RCR ) es un proceso de replicación unidireccional de ácidos nucleicos que permite sintetizar rápidamente múltiples copias de moléculas circulares de ADN o ARN , como plásmidos , genomas de bacteriófagos y el genoma de ARN circular de viroides . Algunos virus eucariotas también replican su ADN o ARN mediante el mecanismo de círculo rodante.

Como una versión simplificada de la replicación natural en círculo rodante , una técnica de amplificación de ADN isotérmica , se desarrolló la amplificación en círculo rodante (RCA). El mecanismo RCA se utiliza ampliamente en biología molecular y nanotecnología biomédica , especialmente en el campo de la biodetección (como método de amplificación de señales). [ 1 ]

replicación del ADN circular

Ilustración de la replicación de un círculo rodante.

La replicación del ADN en círculo rodante se inicia mediante una proteína iniciadora codificada por el ADN del plásmido o bacteriófago, que corta una de las hebras de la molécula de ADN circular de doble cadena en un sitio llamado origen de doble cadena (DSO). La proteína iniciadora permanece unida al extremo 5' fosfato de la hebra cortada, y el extremo 3' hidroxilo libre se libera para servir como cebador para la síntesis de ADN por una ADN polimerasa del huésped (como la ADN polimerasa III ). Utilizando la hebra intacta como molde, la replicación procede alrededor de la molécula de ADN circular, desplazando la hebra cortada como ADN monocatenario. El desplazamiento de la hebra cortada es llevado a cabo por una helicasa codificada por el huésped ; PcrA (la abreviatura de copia de plásmido reducida) desempeña esta función de helicasa en varios sistemas de plásmidos Gram positivos bien estudiados, actuando en presencia de la proteína iniciadora de la replicación del plásmido.

La síntesis continua de ADN puede producir múltiples copias lineales monocatenarias del ADN original en una serie continua cabeza con cola llamada concatémero . Estas copias lineales se pueden convertir en moléculas circulares bicatenarias mediante el siguiente proceso:

Primero, la proteína iniciadora realiza una nueva incisión en el ADN para finalizar la síntesis de la primera hebra (hebra conductora). A continuación, la ARN polimerasa y la ADN polimerasa III replican el ADN del origen monocatenario (SSO) para formar otra molécula circular de doble hebra. La ADN polimerasa I elimina el cebador, reemplazándolo con ADN, y la ADN ligasa une los extremos para formar otra molécula de ADN circular de doble hebra.

En resumen, una replicación típica de ADN en círculo rodante tiene cinco pasos: [ 2 ]

  1. El ADN bicatenario circular será "cortado".
  2. El extremo 3' se alarga utilizando ADN "sin cortes" como cadena principal (molde); el extremo 5' se desplaza.
  3. El ADN desplazado es una hebra rezagada y se convierte en bicatenario mediante una serie de fragmentos de Okazaki .
  4. Replicación tanto del ADN monocatenario "sin muescas" como del desplazado.
  5. El ADN desplazado se circulariza.

Virología

Replicación del ADN viral

Algunos virus de ADN replican su información genómica en las células huésped mediante replicación en círculo rodante. Por ejemplo, el herpesvirus humano 6 (HHV-6) expresa un conjunto de "genes tempranos" que se cree que participan en este proceso. [ 3 ] Durante la encapsidación, el complejo de terminasa viral escinde los concatémeros de ADN resultantes en genomas de longitud unitaria en sitios especificados por las señales de empaquetamiento pac1 y pac2. [ 4 ]

Un modelo para la replicación en círculo rodante del VPH16.

El virus del papiloma humano tipo 16 (VPH-16) es otro virus que emplea la replicación rodante para producir descendencia a una alta tasa. El VPH-16 infecta las células epiteliales humanas y posee un genoma circular de doble cadena. Durante la replicación, en el origen, el hexámero E1 se enrolla alrededor del ADN de cadena simple y se mueve en dirección 3' a 5'. En la replicación bidireccional normal, las dos proteínas de replicación se disocian al colisionar, pero en el VPH-16 se cree que el hexámero E1 no se disocia, lo que da lugar a una replicación rodante continua. Se cree que este mecanismo de replicación del VPH puede tener implicaciones fisiológicas en la integración del virus en el cromosoma del huésped y su eventual progresión hacia el cáncer de cuello uterino . [ 5 ]

Además, el geminivirus también utiliza la replicación en círculo rodante como mecanismo de replicación. Es un virus responsable de la destrucción de muchos cultivos importantes, como la yuca, el algodón, las legumbres, el maíz, el tomate y el quimbombó. El virus posee un ADN circular monocatenario que se replica en las células de la planta huésped. Todo el proceso se inicia mediante la proteína iniciadora de la replicación del geminivirus, Rep, que también se encarga de modificar el entorno del huésped para que actúe como parte de la maquinaria de replicación. Rep es sorprendentemente similar a la mayoría de las demás proteínas iniciadoras de la replicación en círculo rodante de las eubacterias, con la presencia de los motivos I, II y III en su extremo N-terminal. Durante la replicación en círculo rodante, el ADN monocatenario del geminivirus se convierte en ADN bicatenario y Rep se une a este último en la secuencia de origen TAATATTAC. Después de que Rep, junto con otras proteínas de replicación, se une al ADN bicatenario, forma un bucle en el que Rep corta el motivo de nonanucleótido conservado TAATATT↓AC entre los nucleótidos 7 y 8, permanece unido covalentemente al extremo 5' y deja un grupo 3'-OH libre que inicia la síntesis de ADN. Rep desenrolla el dúplex con polaridad 3'→5' a lo largo del molde, lo que permite que las polimerasas del huésped sinteticen y desplacen la nueva cadena viral, generando finalmente una nueva cadena de ADN monocatenario y una cadena de ADN concatémera. [ 6 ]

Los intermediarios de replicación del ADN del bacteriófago T4 incluyen estructuras concatéméricas circulares y ramificadas . [ 7 ] Es probable que estas estructuras reflejen un mecanismo de replicación en círculo rodante.

Replicación del ARN viral

Algunos virus de ARN y viroides también replican su genoma mediante replicación de ARN en círculo rodante. En el caso de los viroides, existen dos vías alternativas de replicación de ARN seguidas respectivamente por miembros de la familia Pospiviroidae (replicación asimétrica) y Avsunviroidae (replicación simétrica).

Replicación en círculo rodante del ARN viral

En la familia Pospiviroidae (similar a PSTVd), el ARN circular de cadena positiva es transcrito por una ARN polimerasa del huésped en cadenas negativas oligoméricas y luego en cadenas positivas oligoméricas. [ 8 ] Estas cadenas positivas oligoméricas son escindidas por una ARNasa del huésped y ligadas por una ARN ligasa del huésped para reformar el ARN circular monomérico de cadena positiva. Esto se denomina vía asimétrica de replicación en círculo rodante. Los viroides de la familia Avsunviroidae (similar a ASBVd) replican su genoma a través de la vía simétrica de replicación en círculo rodante. [ 9 ] En esta vía simétrica, las cadenas negativas oligoméricas son primero escindidas y ligadas para formar cadenas negativas monoméricas, y luego se transcriben en cadenas positivas oligoméricas. Estas cadenas positivas oligoméricas son luego escindidas y ligadas para reformar la cadena positiva monomérica. La vía de replicación simétrica recibió este nombre porque tanto las cadenas positivas como las negativas se producen de la misma manera.

La escisión de las cadenas oligoméricas positivas y negativas está mediada por la estructura de ribozima cabeza de martillo autoescindible presente en los Avsunviroidae, pero dicha estructura está ausente en los Pospiviroidae. [ 10 ]

Amplificación de círculo rodante (RCA)

El mecanismo molecular de la amplificación por círculo rodante (RCA)

La forma derivada de la replicación en círculo rodante se ha utilizado con éxito para la amplificación de ADN a partir de cantidades muy pequeñas de material de partida. [ 1 ] Esta técnica de amplificación se denomina amplificación en círculo rodante (RCA). A diferencia de las técnicas convencionales de amplificación de ADN, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , la RCA es una técnica de amplificación de ácidos nucleicos isotérmica en la que la polimerasa añade continuamente nucleótidos individuales a un cebador hibridado a una plantilla circular, lo que da como resultado un largo concatémero de ADN monocatenario que contiene decenas o cientos de repeticiones en tándem (complementarias a la plantilla circular). [ 11 ]

Para realizar una reacción RCA se requieren cinco componentes importantes:

  1. Una ADN polimerasa
  2. Un tampón adecuado que sea compatible con la polimerasa.
  3. Un cebador corto de ADN o ARN
  4. Una plantilla de ADN circular
  5. Trifosfatos de desoxinucleótidos (dNTP)
Métodos de detección del producto RCA

Las polimerasas utilizadas en la amplificación por desplazamiento de cadena (RCA) son la ADN polimerasa Phi29 , Bst y Vent exo para la amplificación de ADN, y la ARN polimerasa T7 para la amplificación de ARN. Dado que la ADN polimerasa Phi29 posee la mejor procesividad y capacidad de desplazamiento de cadena entre todas las polimerasas mencionadas, es la más utilizada en las reacciones de RCA. A diferencia de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la RCA es isotérmica, pero la temperatura de reacción depende de la polimerasa; por ejemplo, la ADN polimerasa Φ29 se utiliza comúnmente a 30 °C, mientras que la ADN polimerasa Bst se utiliza comúnmente a unos 60-65 °C. La RCA puede realizarse tanto en solución libre como sobre objetivos inmovilizados (amplificación en fase sólida).

Normalmente, una reacción de amplificación por desplazamiento de cadena de ADN (RCA) consta de tres pasos:

  1. La ligación de plantillas circulares puede realizarse mediante ligación enzimática mediada por plantilla (por ejemplo, con la ligasa de ADN T4) o mediante ligación sin plantilla utilizando ligasas de ADN especiales (es decir, CircLigase).
  2. Alargamiento de ADN monocatenario inducido por cebadores . Se pueden emplear varios cebadores para hibridar con el mismo círculo. Como resultado, se pueden iniciar múltiples eventos de amplificación, produciendo múltiples productos de RCA ("RCA multicebada").
  3. La detección y visualización del producto de amplificación se realiza comúnmente mediante detección fluorescente, utilizando dNTP conjugados con fluoróforos, sondas moleculares complementarias unidas a fluoróforos o marcadas con fluorescencia . Además de los métodos fluorescentes, la electroforesis en gel también se utiliza ampliamente para la detección del producto de RCA.

Amplificación de la amplificación

La RCA produce una amplificación lineal del ADN, ya que cada plantilla circular crece a una velocidad determinada durante un cierto tiempo. Para aumentar el rendimiento y lograr una amplificación exponencial como la PCR, se han investigado varios enfoques. Uno de ellos es la amplificación en círculo rodante hiperramificada (HRCA), donde se añaden y extienden cebadores que se unen a los productos originales de la RCA. [ 12 ] De esta forma, la RCA original crea más plantilla que puede amplificarse. Otro método es la amplificación de círculo a círculo (C2CA), donde los productos de la RCA se digieren con una enzima de restricción y se ligan a nuevas plantillas circulares mediante un oligonucleótido de restricción, seguido de una nueva ronda de RCA con una mayor cantidad de plantillas circulares para la amplificación. [ 13 ] Otro método es el denominado super RCA (sRCA), donde se utilizan sondas de candado complementarias a una región de interés en el producto de la RCA para amplificar el tamaño del producto inicial de círculo rodante, lo que permite su detección mediante un citómetro de flujo . [ 14 ]

Aplicaciones de RCA

Ilustración de inmuno-RCA

La amplificación por desplazamiento de cadena (RCA) puede amplificar un único evento de unión molecular más de mil veces, lo que la hace particularmente útil para detectar dianas con una abundancia ultrabaja. Las reacciones de RCA pueden realizarse no solo en soluciones libres, sino también sobre superficies sólidas como vidrio, microesferas o nanoesferas, placas de micropocillos, dispositivos microfluídicos o incluso tiras de papel. Esta característica la convierte en una herramienta muy potente para amplificar señales en inmunoensayos de fase sólida (por ejemplo, ELISA ). De esta manera, la RCA se está convirtiendo en una herramienta de amplificación de señales altamente versátil con amplias aplicaciones en genómica, proteómica , diagnóstico y biodetección.

Inmuno-RCA

La inmuno-RCA es un método de amplificación de señal isotérmica para la detección y cuantificación de proteínas con alta especificidad y sensibilidad. Esta técnica combina dos campos: la RCA, que permite la amplificación de nucleótidos, y el inmunoensayo, que utiliza anticuerpos específicos para biomarcadores intracelulares o libres. Como resultado, la inmuno-RCA proporciona una señal amplificada específica (alta relación señal-ruido), lo que la hace adecuada para detectar, cuantificar y visualizar marcadores de proteínas de baja abundancia en inmunoensayos en fase líquida [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] e inmunohistoquímica .

La inmuno-RCA sigue una reacción inmunoadsorbente típica en ELISA o tinción de tejidos mediante inmunohistoquímica. [ 18 ] Los anticuerpos de detección utilizados en la reacción inmuno-RCA se modifican mediante la unión de un oligonucleótido de ADN monocatenario al extremo de las cadenas pesadas. De esta forma, la sección Fab (fragmento de unión al antígeno ) del anticuerpo de detección puede unirse a antígenos específicos y el oligonucleótido puede servir como cebador de la reacción RCA.

El procedimiento típico de inmuno-RCA mediado por anticuerpos es el siguiente:

Ilustración de inmuno-RCA basado en aptámeros

1. Un anticuerpo de detección reconoce una proteína diana específica. Este anticuerpo también está unido a un cebador de oligonucleótido.

2. Cuando hay ADN circular presente, este se hibrida y el cebador coincide con la secuencia complementaria del ADN circular.

3. La secuencia complementaria de la plantilla de ADN circular se copia cientos de veces y permanece unida al anticuerpo.

4. La salida de RCA (ADN monocatenario alargado) se detecta con sondas fluorescentes utilizando un microscopio de fluorescencia o un lector de microplacas.

Inmuno-RCA basado en aptámeros

Además de la inmuno-RCA mediada por anticuerpos, el cebador RCA de ssDNA también puede conjugarse al extremo 3' de un aptámero de ADN. La cola del cebador puede amplificarse mediante amplificación por círculo rodante. El producto puede visualizarse mediante el marcaje con un reportero fluorescente. [ 19 ] El proceso se ilustra en la figura de la derecha. [ 20 ]

Genotipado de ADN

Las sondas de candado (o sondas de inversión molecular ) pueden utilizarse para genotipar ADN directamente. Esto se logra diseñando cadenas lineales de ADN que contienen brazos de hibridación complementarios al ADN de interés, y que se diferencian por secuencias únicas para sondas fluorescentes presentes en su estructura. Cuando una de las sondas de candado se une a su diana, se circulariza y, por lo tanto, puede amplificarse. Tras la amplificación, la secuencia única en su estructura puede analizarse y detectarse mediante diversos métodos, como la microscopía [ 21 ] .

Detección de mutaciones raras

Los eventos moleculares raros, como las mutaciones en biopsias de cáncer, pueden detectarse mediante amplificación por círculo rodante. Esto se puede hacer preamplificando el gen de interés mediante PCR (lo que aumenta la sensibilidad del ensayo) y luego circularizando los genes amplificados sobre una cadena molde de ADN. Los genes circularizados se amplifican, al igual que las mutaciones que contienen. Los productos que generan se analizan con un segundo conjunto de sondas que difieren en un solo nucleótido en sus brazos de hibridación (T, G, C, A) y se circularizan. Estas sondas secundarias se amplifican, lo que aumenta la detectabilidad de la mutación presente en el ADN genómico inicial [ 22 ] .

Otras aplicaciones de RCA

Diversos derivados de la RCA se han utilizado ampliamente en el campo de la biodetección. Por ejemplo, la RCA se ha utilizado con éxito para detectar la presencia de ADN viral y bacteriano en muestras clínicas, [ 23 ] [ 24 ] lo cual es muy beneficioso para el diagnóstico rápido de enfermedades infecciosas . También se ha utilizado como método de amplificación de señal en chip para ensayos de microarrays de ácidos nucleicos (tanto ADN como ARN) . [ 1 ]

Además de su función de amplificación en aplicaciones de biodetección, la técnica RCA también puede aplicarse a la construcción de nanoestructuras de ADN e hidrogeles de ADN. Los productos de RCA también pueden utilizarse como plantillas para el ensamblaje periódico de nanoespecies o proteínas, la síntesis de nanocables metálicos [ 25 ] y la formación de nanoislas [ 1 ] .

Véase también

Referencias

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