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Transcriptómica de células individuales

La transcriptómica unicelular se refiere a la cuantificación y el análisis de los transcriptomas de células individuales . [ 1 ] La transcriptómica unicelular permite desentraña...

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La transcriptómica unicelular se refiere a la cuantificación y el análisis de los transcriptomas de células individuales . [ 1 ] La transcriptómica unicelular permite desentrañar poblaciones celulares heterogéneas , reconstruir vías de desarrollo celular y modelar la dinámica transcripcional. [ 2 ]

Fondo

El desarrollo de la secuenciación de ARN de alto rendimiento (RNA-seq) y los microarrays ha convertido el análisis de la expresión génica en una práctica habitual. Anteriormente, el análisis de ARN se limitaba al seguimiento de transcritos individuales mediante Northern blots o PCR cuantitativa . El mayor rendimiento y la velocidad permiten a los investigadores caracterizar con frecuencia los perfiles de expresión de poblaciones de miles de células. Los datos de los ensayos masivos han permitido identificar genes con expresión diferencial en distintas poblaciones celulares y descubrir biomarcadores . [ 3 ]

Experimento de secuenciación de ARN

Estos estudios son limitados, ya que proporcionan mediciones para tejidos completos y, como resultado, muestran un perfil de expresión promedio para todas las células constituyentes. Esto tiene un par de inconvenientes. En primer lugar, los diferentes tipos de células dentro del mismo tejido pueden tener funciones distintas en los organismos multicelulares. A menudo forman subpoblaciones con perfiles transcripcionales únicos. Las correlaciones en la expresión génica de las subpoblaciones a menudo pueden pasar desapercibidas debido a la falta de identificación de las subpoblaciones. [ 1 ] En segundo lugar, los ensayos masivos no permiten reconocer si un cambio en el perfil de expresión se debe a un cambio en la regulación o la composición, por ejemplo, si un tipo de célula llega a dominar la población. Por último, cuando el objetivo es estudiar la progresión celular a través de la diferenciación , los perfiles de expresión promedio solo pueden ordenar las células por tiempo en lugar de por etapa de desarrollo. En consecuencia, no pueden mostrar tendencias en los niveles de expresión génica específicos de ciertas etapas. [ 4 ]

Los recientes avances en biotecnología permiten medir la expresión génica en cientos o miles de células individuales simultáneamente. Si bien estos avances en las tecnologías transcriptómicas han posibilitado la generación de datos transcriptómicos de células individuales, también han planteado nuevos desafíos computacionales y analíticos. Los bioinformáticos pueden utilizar técnicas de secuenciación de ARN masiva para datos de células individuales. Sin embargo, se han tenido que diseñar muchos enfoques computacionales nuevos para este tipo de datos con el fin de facilitar un estudio completo y detallado de los perfiles de expresión de células individuales. [ 5 ]

Pasos experimentales

Hasta el momento no existe una técnica estandarizada para generar datos de células individuales: todos los métodos deben incluir el aislamiento celular de la población, la formación de lisados , la amplificación mediante transcripción inversa y la cuantificación de los niveles de expresión. Las técnicas comunes para medir la expresión son la PCR cuantitativa o la secuenciación de ARN (RNA-seq). [ 6 ]

Aislamiento de células individuales

Flujo de trabajo de clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS)

Existen varios métodos para aislar y amplificar células para análisis unicelulares, que difieren principalmente en el rendimiento y el potencial de selección celular. Las técnicas de bajo rendimiento, como el micropipeteo , la aspiración citoplasmática [ 7 ] y la microdisección por captura láser , suelen aislar cientos de células, pero permiten una selección celular deliberada.

Los métodos de alto rendimiento permiten el aislamiento rápido de cientos a decenas de miles de células. [ 8 ] Los enfoques comunes de alto rendimiento incluyen la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y el uso de dispositivos microfluídicos . Las plataformas microfluídicas a menudo aíslan células individuales ya sea por separación mecánica en micropocillos (p. ej., BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform, CellMicrosystems CellRaft) o por encapsulación dentro de gotas (p. ej., 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop, Dolomite Bio Nadia). [ 9 ] Además, se han desarrollado protocolos optimizados mediante la integración de estas técnicas de aislamiento directamente con flujos de trabajo de scRNA-seq. Por ejemplo, la combinación de FACS con scRNA-seq dio lugar a protocolos como SORT-seq, [ 10 ] y una lista de estudios que utilizan SORT-seq se puede encontrar aquí. [ 11 ] De manera similar, la integración de dispositivos microfluídicos con scRNA-seq se ha optimizado en gran medida en protocolos como los desarrollados por 10x Genomics . [ 12 ]

Las técnicas de secuenciación de ARN de células individuales que se basan en el código de barras de grupos divididos pueden etiquetar células de forma única sin necesidad de aislar células individuales, incluidas sci-RNA-seq, SPLiT-seq y microSPLiT. [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]

PCR cuantitativa (qPCR)

Para medir el nivel de expresión de cada transcrito, se puede aplicar la qPCR. Se utilizan cebadores específicos para cada gen para amplificar el gen correspondiente, al igual que en la PCR convencional , y como resultado, los datos generalmente solo se obtienen para tamaños de muestra de menos de 100 genes. La inclusión de genes de referencia , cuya expresión debería ser constante en las condiciones, se utiliza para la normalización. Los genes de referencia más utilizados incluyen GAPDH y α- actina , aunque la fiabilidad de la normalización mediante este proceso es cuestionable, ya que existe evidencia de que el nivel de expresión puede variar significativamente. [ 16 ] Se utilizan colorantes fluorescentes como moléculas reporteras para detectar el producto de PCR y monitorizar el progreso de la amplificación: el aumento de la intensidad de fluorescencia es proporcional a la concentración del amplicón . Se realiza una gráfica de fluorescencia frente al número de ciclos y se utiliza un nivel de fluorescencia umbral para encontrar el número de ciclos en el que la gráfica alcanza este valor. El número de ciclos en este punto se conoce como ciclo umbral (C t ) y se mide para cada gen. [ 17 ]

Secuenciación de ARN de célula única (scRNA-Seq)

La técnica de secuenciación de ARN de célula única convierte una población de ARN en una biblioteca de fragmentos de ADNc que pueden secuenciarse. En tecnologías basadas en microgotas, como 10x Genomics Chromium, las células individuales se aíslan en microgotas junto con microesferas recubiertas con oligonucleótidos con código de barras. Tanto las células como las microesferas se suministran en cantidades limitadas, de modo que la coexistencia de múltiples células y microesferas es un evento muy raro. Las células se lisan dentro de las microgotas y los ARN se transcriben inversamente utilizando los oligonucleótidos oligo-dT con código de barras como cebadores. Tras la transcripción inversa, la emulsión se rompe, liberando el ADNc con código de barras de todas las microgotas en una única solución. Este ADNc combinado se prepara para la secuenciación mediante la adición de adaptadores de secuenciación y la amplificación por PCR.

Flujo de trabajo típico de secuenciación de ARN de células individuales. Se aíslan células individuales de una muestra en pocillos o gotas, se generan y amplifican bibliotecas de ADNc, se secuencian las bibliotecas y se generan matrices de expresión para análisis posteriores, como la identificación del tipo celular.

Estos fragmentos se secuencian mediante técnicas de secuenciación de próxima generación de alto rendimiento y las lecturas se mapean al genoma de referencia , lo que proporciona un recuento del número de lecturas asociadas a cada gen. [ 18 ] Los transcritos de una célula en particular se identifican mediante el código de barras único de cada célula. [ 19 ] [ 20 ]

La normalización de los datos de RNA-Seq tiene en cuenta la variación célula a célula en la eficiencia de la formación de la biblioteca de ADNc y la secuenciación. Un método se basa en el uso de ARN extrínsecos añadidos en cantidades iguales a cada lisado celular y se utiliza para normalizar el recuento de lecturas según el número de lecturas mapeadas al ARNm añadido . [ 21 ] Otro control utiliza identificadores moleculares únicos (UMI), secuencias cortas de ADN (6-10 nt) que se añaden a cada ADNc antes de la amplificación y actúan como un código de barras para cada molécula de ADNc. La normalización se logra utilizando el número de UMI únicos asociados a cada gen para tener en cuenta las diferencias en la eficiencia de amplificación. [ 22 ]

Se ha combinado una combinación de spike-ins , UMIs y otros enfoques para ayudar a identificar artefactos durante la preparación de la biblioteca [ 23 ] y para una normalización más precisa.

Aplicaciones

La scRNA-Seq se está utilizando ampliamente en diversas disciplinas biológicas, incluyendo el desarrollo, la neurología , [ 24 ] la oncología , [ 25 ] [ 26 ] [ 27 ] las enfermedades autoinmunes , [ 28 ] las enfermedades infecciosas , [ 29 ] las enfermedades cerebrales , [ 30 ] y la virología ambiental . [ 31 ] [ 32 ] Se han publicado varios protocolos de scRNA-Seq: Tang et al., [ 33 ] STRT, [ 34 ] SMART-seq, [ 35 ] CEL-seq, [ 36 ] RAGE-seq, [ 37 ] Quartz-seq [ 38 ] y C1-CAGE. [ 39 ] Estos protocolos difieren en términos de estrategias para la transcripción inversa, la síntesis y amplificación de ADNc, y la posibilidad de incorporar códigos de barras específicos de secuencia (es decir, UMI ) o la capacidad de procesar muestras agrupadas. [ 40 ] En 2017, se introdujeron dos enfoques para medir simultáneamente la expresión de ARNm y proteínas de células individuales a través de anticuerpos marcados con oligonucleótidos conocidos como REAP-seq, [ 41 ] y CITE-seq. [ 42 ] Una revisión de 2025 en Science informó que la aplicación de transcriptómica de células individuales a comunidades microbianas revela heterogeneidad funcional dentro de las comunidades intestinales, respuestas características a antibióticos y la dinámica de elementos genéticos móviles . Pountain, Andrew W.; Yanai, Itai (2025-09-04). "Disecando comunidades microbianas con análisis de transcriptoma de células individuales" . Science . 389 ( 6764) eadp6252. doi : 10.1126/science.adp6252 . PMC 12467864. PMID 40906858 .  

La secuenciación de ARN de célula única (scRNA-Seq) ha proporcionado información considerable sobre el desarrollo de embriones y organismos, incluyendo el gusano Caenorhabditis elegans [ 43 ] y la planaria regenerativa Schmidtea mediterranea [ 44 ] [ 45 ] . Los primeros vertebrados que se mapearon de esta manera fueron el pez cebra [ 46 ] [ 47 ] y Xenopus laevis [ 48 ] . En cada caso, se estudiaron múltiples etapas del embrión, lo que permitió mapear todo el proceso de desarrollo célula por célula [ 49 ] . La ciencia reconoció estos avances como el Avance del Año 2018 [ 50 ] .

Consideraciones

Un problema asociado con los datos de células individuales se presenta en forma de distribuciones de expresión génica infladas a cero, conocidas como pérdidas técnicas, que son comunes debido a las bajas concentraciones de ARNm de genes menos expresados ​​que no se capturan en el proceso de transcripción inversa. El porcentaje de moléculas de ARNm en el lisado celular que se detectan suele ser solo del 10-20%. [ 51 ]

Al utilizar ARN de control (spike-ins) para la normalización, se asume que las eficiencias de amplificación y secuenciación del ARN endógeno y del ARN de control son las mismas. Sin embargo, la evidencia sugiere que esto no es así debido a diferencias fundamentales en tamaño y características, como la ausencia de una cola poliadenilada en los ARN de control y, por lo tanto, una longitud menor. [ 52 ] Además, la normalización mediante UMIs asume que la biblioteca de ADNc se ha secuenciado hasta la saturación, lo cual no siempre ocurre. [ 22 ]

En la etapa de amplificación, actualmente se utiliza PCR o transcripción in vitro (IVT) para amplificar el ADNc. Una de las ventajas de los métodos basados ​​en PCR es la capacidad de generar ADNc de longitud completa. Sin embargo, la diferente eficiencia de la PCR en secuencias particulares (por ejemplo, contenido de GC y estructura de retroceso) también puede amplificarse exponencialmente, produciendo bibliotecas con cobertura desigual. Por otro lado, si bien las bibliotecas generadas por IVT pueden evitar el sesgo de secuencia inducido por la PCR, ciertas secuencias pueden transcribirse de manera ineficiente, lo que provoca la pérdida de secuencias o la generación de secuencias incompletas. [ 53 ] [ 54 ]

Entre los desafíos de la secuenciación de ARN de célula única (scRNA-Seq) se encuentran la preservación de la abundancia relativa inicial de ARNm en una célula y la identificación de transcritos poco frecuentes. [ 55 ] El paso de transcripción inversa es fundamental, ya que la eficiencia de la reacción de RT determina la cantidad de ARN celular que finalmente será analizada por el secuenciador. La procesividad de las transcriptasas inversas y las estrategias de cebado utilizadas pueden afectar la producción de ADNc de longitud completa y la generación de bibliotecas sesgadas hacia el extremo 3' o 5' de los genes.

Otra consideración importante al secuenciar tipos celulares grandes y ramificados, como las neuronas , radica en la eliminación de procesos distales que contienen reservorios locales de ARN durante el proceso de aislamiento de células individuales. En estas células, los conjuntos de datos de scRNA-seq solo capturan el transcrito en el cuerpo celular central, omitiendo los transcritos de los reservorios de ARN localizados en procesos celulares que pueden estar involucrados en la traducción local u otros mecanismos subcelulares mediados por ARN. En el cerebro, se ha estimado que más del 40 % del ARN total no se secuencia mediante scRNA-seq debido a la prevalencia de transcriptomas locales en procesos celulares como axones , dendritas , mielina y pies terminales . [ 56 ]

Análisis de datos

Los análisis basados ​​en datos de células individuales parten de la base de que la entrada es una matriz de recuentos de expresión génica normalizados, generados mediante los métodos descritos anteriormente, y pueden ofrecer oportunidades que no se pueden obtener mediante el análisis de datos a granel.

Se proporcionaron tres ideas principales: [ 57 ]

  1. Identificación y caracterización de los tipos celulares y su organización espacial en el tiempo.
  2. Inferencia de redes reguladoras de genes y su fuerza en células individuales
  3. Clasificación del componente estocástico de la transcripción

Las técnicas descritas han sido diseñadas para ayudar a visualizar y explorar patrones en los datos con el fin de facilitar la revelación de estas tres características.

Agrupación

Datos gaussianos K-Means
Dendrograma del iris generado mediante un algoritmo de agrupamiento jerárquico.

La agrupación permite la formación de subgrupos en la población celular. Las células pueden agruparse según su perfil transcriptómico para analizar la estructura de la subpoblación e identificar tipos o subtipos celulares poco frecuentes. Alternativamente, los genes pueden agruparse según sus estados de expresión para identificar genes covariantes. Se ha utilizado una combinación de ambos enfoques de agrupación, conocida como biclusterización , para agrupar simultáneamente genes y células y encontrar genes que se comportan de manera similar dentro de los grupos celulares. [ 58 ]

Los métodos de agrupamiento que se pueden aplicar son el agrupamiento K-means , que forma grupos disjuntos, o el agrupamiento jerárquico , que forma particiones anidadas.

Biclusterización

El biclustering ofrece varias ventajas al mejorar la resolución del agrupamiento. Mediante el biclustering se pueden identificar genes que solo son informativos para un subconjunto de células y, por lo tanto, solo se expresan en ellas. Además, este método permite identificar genes con comportamiento similar que diferencian un grupo celular de otro. [ 59 ]

Reducción de dimensionalidad

Ejemplo de PCA de frecuencias de haplogrupos del cromosoma Y en poblaciones guineanas y otras poblaciones africanas

Los algoritmos de reducción de dimensionalidad , como el análisis de componentes principales (PCA), t-SNE y UMAP, se pueden utilizar para simplificar los datos para su visualización y detección de patrones, transformando las celdas de un espacio de alta dimensión a uno de menor dimensión . El resultado de este método produce gráficos donde cada celda es un punto en un espacio bidimensional o tridimensional. La reducción de dimensionalidad se utiliza con frecuencia antes de la agrupación, ya que las celdas en dimensiones altas pueden parecer erróneamente cercanas debido a que las métricas de distancia se comportan de forma poco intuitiva. [ 60 ]

Análisis de componentes principales

La técnica más utilizada es el PCA, que identifica las direcciones de los componentes principales de mayor varianza y transforma los datos de manera que el primer componente principal tenga la mayor varianza posible, y los componentes principales sucesivos, a su vez, tengan cada uno la mayor varianza posible, manteniendo la ortogonalidad con respecto a los componentes precedentes. La contribución de cada gen a cada componente se utiliza para inferir qué genes contribuyen más a la varianza en la población y participan en la diferenciación de distintas subpoblaciones. [ 61 ]

Expresión diferencial

La detección de diferencias en el nivel de expresión génica entre dos poblaciones se realiza utilizando datos transcriptómicos tanto de células individuales como de muestras masivas. Se han diseñado métodos especializados para datos de células individuales que consideran características de células individuales como pérdidas técnicas y la forma de la distribución, por ejemplo, bimodal frente a unimodal . [ 62 ]

Enriquecimiento de la ontología genética

Los términos de la ontología genética describen las funciones de los genes y las relaciones entre esas funciones en tres clases:

  1. Función molecular
  2. Componente celular
  3. Proceso biológico

El enriquecimiento de términos de Gene Ontology (GO) es una técnica que se utiliza para identificar qué términos GO están sobrerrepresentados o infrarrepresentados en un conjunto de genes determinado. En el análisis de células individuales, la lista de genes de interés se puede seleccionar en función de los genes expresados ​​diferencialmente o de grupos de genes generados mediante biclusterización. El número de genes anotados con un término GO en la lista de entrada se normaliza con respecto al número de genes anotados con un término GO en el conjunto de referencia de todos los genes del genoma para determinar la significación estadística . [ 63 ]

Ordenación pseudotemporal

Grafo con árbol de expansión mínima

El ordenamiento pseudotemporal (o inferencia de trayectorias) es una técnica que busca inferir la dinámica de la expresión génica a partir de datos de células individuales. El método intenta ordenar las células de manera que las similares se encuentren cerca unas de otras. Esta trayectoria celular puede ser lineal, pero también puede bifurcarse o seguir estructuras gráficas más complejas. Por lo tanto, la trayectoria permite inferir la dinámica de la expresión génica y ordenar las células según su progresión a través de la diferenciación o la respuesta a estímulos externos. El método se basa en la suposición de que las células siguen la misma ruta durante el proceso de interés y que su estado transcripcional se correlaciona con su progresión. El algoritmo puede aplicarse tanto a poblaciones mixtas como a muestras temporales.

Se han desarrollado más de 50 métodos para el ordenamiento pseudotemporal, y cada uno tiene sus propios requisitos de información previa (como celdas iniciales o datos de series temporales), topologías detectables y metodología. [ 64 ] Un ejemplo de algoritmo es el algoritmo Monocle [ 65 ] que lleva a cabo la reducción de dimensionalidad de los datos, construye un árbol de expansión mínima utilizando los datos transformados, ordena las celdas en pseudotiempo siguiendo el camino conectado más largo del árbol y, en consecuencia, etiqueta las celdas por tipo. Otro ejemplo es el algoritmo de pseudotiempo de difusión (DPT), [ 63 ] que utiliza un mapa de difusión y un proceso de difusión . Otra clase de métodos como MARGARET [ 66 ] emplean partición de grafos para capturar topologías de trayectoria complejas como trayectorias desconectadas y multifurcadas.

Inferencia de red

La inferencia de redes de regulación génica es una técnica que busca construir una red, representada como un grafo, donde los nodos representan los genes y las aristas indican interacciones correguladoras. El método se basa en la suposición de que una fuerte relación estadística entre la expresión de los genes es un indicio de una posible relación funcional. [ 67 ] El método más comúnmente utilizado para medir la fuerza de una relación estadística es la correlación . Sin embargo, la correlación no logra identificar relaciones no lineales , por lo que se utiliza la información mutua como alternativa. Los grupos de genes vinculados en una red representan genes que experimentan cambios coordinados en su expresión. [ 68 ]

Integración

La presencia o fuerza de los efectos técnicos y los tipos de células observadas a menudo difieren en los conjuntos de datos de transcriptómica de células individuales generados utilizando diferentes protocolos experimentales y bajo diferentes condiciones. Esta diferencia produce fuertes efectos de lote que pueden sesgar los resultados de los métodos estadísticos aplicados a través de lotes, particularmente en presencia de confusión . [ 69 ] Como resultado de las propiedades mencionadas de los datos transcriptómicos de células individuales, se observó que los métodos de corrección de lote desarrollados para datos de secuenciación masiva tenían un rendimiento deficiente. En consecuencia, los investigadores desarrollaron métodos estadísticos para corregir los efectos de lote que son robustos a las propiedades de los datos transcriptómicos de células individuales para integrar datos de diferentes fuentes o lotes experimentales. Laleh Haghverdi realizó un trabajo fundamental en la formulación del uso de vecinos más cercanos mutuos entre cada lote para definir vectores de corrección de lote. [ 70 ] Con estos vectores, se pueden fusionar conjuntos de datos que incluyen al menos un tipo de célula compartido. Un enfoque ortogonal implica la proyección de cada conjunto de datos en un espacio compartido de baja dimensión utilizando análisis de correlación canónica . [ 71 ] Los vecinos más cercanos mutuos y el análisis de correlación canónica también se han combinado para definir "anclas" de integración que comprenden células de referencia en un conjunto de datos, a las cuales se normalizan las células de consulta en otro conjunto de datos. [ 72 ] Otra clase de métodos (por ejemplo, scDREAMER [ 73 ] ) utiliza modelos generativos profundos como autoencoders variacionales para aprender representaciones celulares latentes invariantes por lotes que pueden usarse para tareas posteriores como la agrupación de tipos de células, la eliminación de ruido de vectores de expresión génica de células individuales y la inferencia de trayectorias . [ 66 ]

Comunicación célula a célula

Las herramientas de comunicación célula-célula aprovechan la expresión de pares de ligando y receptor afines en distintos pares de células para predecir interacciones putativas entre células. [ 74 ] Una herramienta pionera es CellPhoneDB, [ 75 ] que incluía una base de datos curada de complejos de receptores e interacciones ligando-receptor. El método también implementó una prueba estadística al evaluar la expresión del ligando-receptor en el par de células correspondiente. Un análisis avanzado interesante se da en escenarios donde hay dos condiciones disponibles (enfermedad vs. controles). Aquí, interesa encontrar interacciones célula-célula específicas para las condiciones de enfermedad o control [ 76 ] . Métodos recientes como Renoir [ 77 ] integran datos de transcriptómica espacial y de célula única para inferir la comunicación célula-célula específica del contexto dentro de los tejidos.

Análisis del Atlas de Enfermedades

Con la reducción del costo de las células individuales, es posible medir datos de células individuales en grandes cohortes de enfermedades con hasta 100 muestras individuales y millones de células. Esto plantea varios desafíos, como la variabilidad individual y las propiedades multiescala de los datos; cada experimento con células individuales representa una distribución de células. MILO [ 78 ] aborda la variabilidad individual codificando los datos de células individuales como un grafo k-nn seguido de una prueba de abundancia diferencial. Esto permite encontrar vecindarios celulares asociados a una condición de enfermedad particular. La teoría del transporte óptimo es otro marco para abordar la naturaleza multiescala del atlas de enfermedades de células individuales. Al codificar los experimentos de células individuales de un paciente como una distribución de células, la distancia de Wasserstein basada en el transporte óptimo permite medir una distancia entre dos pacientes. Esto se puede utilizar para la agrupación a nivel de muestra y el análisis de trayectorias, como lo exploran PILOT [ 79 ] y QOT [ 80 ] .

marcos de software

Un pilar importante del análisis de células individuales son los paquetes de software que proporcionan funcionalidades para la verificación de calidad, la normalización, la agrupación y el análisis posterior descritos anteriormente. También proporcionan contenedores de datos para el almacenamiento y la representación de los datos de células individuales analizados. Seurat es el primer y posiblemente el marco más completo para el análisis de células individuales. Scanpy es una alternativa para el lenguaje Python. Otros paquetes de software ofrecen tareas específicas de análisis de datos. Ejemplos notables son LIANA+ para el análisis de la comunicación célula-célula, scVI como un paquete que ofrece autoencoders variacionales para el análisis de datos de células individuales, y PILOT como un paquete para el análisis a nivel de muestra de atlas de enfermedades [ 81 ] [ 82 ].

Véase también

Referencias

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  • Análisis de la heterogeneidad tumoral mediante transcriptómica unicelular.
  • La guía definitiva para la secuenciación de ARN de células individuales, elaborada por Single Cell Discoveries, proveedor de servicios de secuenciación de ARN de células individuales.