Análisis de partículas individuales

Las muestras biológicas, y especialmente las muestras incrustadas en hielo vítreo delgado , son altamente sensibles a la radiación, por lo que solo se pueden usar dosis bajas de electrones para obtener imágenes de la muestra. Esta dosis baja, así como las variaciones en el tinte metálico utilizado (si se usa) ^{[ 6 ]} hacen que las imágenes tengan un alto ruido en relación con la señal dada por la partícula que se está observando. Al alinear varias imágenes similares entre sí para que estén registradas y luego promediarlas, se puede obtener una imagen con una mayor relación señal-ruido . Como el ruido está distribuido mayormente de forma aleatoria y las características de la imagen subyacente son constantes, al promediar la intensidad de cada píxel en varias imágenes solo se refuerzan las características constantes. Típicamente, la alineación óptima (una traslación y una rotación en el plano) para mapear una imagen sobre otra se calcula mediante correlación cruzada .

Sin embargo, una micrografía suele contener partículas con diferentes orientaciones y/o conformaciones, por lo que, para obtener promedios de imagen más representativos, se requiere un método para agrupar imágenes de partículas similares en varios conjuntos. Esto se suele llevar a cabo utilizando uno de los diversos algoritmos de análisis de datos y clasificación de imágenes, como el análisis estadístico multivariante y la clasificación jerárquica ascendente, o el agrupamiento k -means .

Con frecuencia se utilizan conjuntos de datos de decenas de miles de imágenes de partículas, y para alcanzar una solución óptima se emplea un procedimiento iterativo de alineación y clasificación, en el que los promedios de imágenes más representativos producidos por la clasificación se utilizan como imágenes de referencia para una alineación posterior de todo el conjunto de datos.

El filtrado de imágenes ( filtrado de paso de banda ) se utiliza a menudo para reducir la influencia de la información de alta y/o baja frecuencia espacial en las imágenes, que puede afectar los resultados de los procedimientos de alineación y clasificación. Esto es particularmente útil en imágenes de tinción negativa . Los algoritmos utilizan transformadas rápidas de Fourier ( FFT ), empleando frecuentemente máscaras de bordes suaves con forma gaussiana en el espacio recíproco para suprimir ciertos rangos de frecuencia. Los filtros de paso alto eliminan las bajas frecuencias espaciales (como los efectos de rampa o gradiente), dejando intactas las frecuencias más altas. Los filtros de paso bajo eliminan las características de alta frecuencia espacial y producen un efecto de desenfoque en los detalles finos.

Debido a la naturaleza de la formación de imágenes en el microscopio electrónico, las imágenes TEM de campo claro se obtienen con un desenfoque significativo . Esto, junto con las características inherentes al sistema de lentes del microscopio, crea un desenfoque en las imágenes capturadas, visible como una función de dispersión puntual . Los efectos combinados de las condiciones de imagen se conocen como función de transferencia de contraste (CTF) y pueden aproximarse matemáticamente como una función en el espacio recíproco. Técnicas especializadas de procesamiento de imágenes, como la inversión de fase y la corrección de amplitud/ filtrado de Wiener , pueden corregir (al menos parcialmente) ^{[ 7 ]} la CTF y permitir reconstrucciones de alta resolución.

Las imágenes de microscopía electrónica de transmisión son proyecciones del objeto que muestran la distribución de densidad a través del mismo, de forma similar a las radiografías médicas. Mediante el teorema de proyección-corte, se puede generar una reconstrucción tridimensional del objeto combinando numerosas imágenes (proyecciones 2D) tomadas desde diferentes ángulos de visión. Idealmente, las proteínas en el hielo vítreo adoptan una distribución aleatoria de orientaciones (o ángulos de visión), lo que permite una reconstrucción bastante isotrópica si se utiliza un gran número de imágenes de partículas. Esto contrasta con la tomografía electrónica , donde los ángulos de visión están limitados debido a la geometría de la muestra/configuración de imagen, lo que da lugar a una reconstrucción anisotrópica . La retroproyección filtrada es un método comúnmente utilizado para generar reconstrucciones 3D en el análisis de partículas individuales, aunque existen muchos algoritmos alternativos. ^{[ 3 ]}

Antes de realizar una reconstrucción, es necesario estimar la orientación del objeto en cada imagen. Se han desarrollado varios métodos para calcular los ángulos de Euler relativos de cada imagen. Algunos se basan en líneas comunes (proyecciones 1D y sinogramas comunes ), mientras que otros utilizan algoritmos iterativos de coincidencia de proyecciones. Este último método parte de un modelo 3D inicial simple y de baja resolución, compara las imágenes experimentales con las proyecciones del modelo y crea un nuevo modelo 3D para aproximarse a una solución.

También existen métodos para realizar reconstrucciones 3D de muestras helicoidales (como el virus del mosaico del tabaco ), aprovechando la simetría helicoidal inherente . Para estas muestras se pueden utilizar tanto métodos en el espacio real (que tratan secciones de la hélice como partículas individuales) como métodos en el espacio recíproco (que utilizan patrones de difracción).

La platina del microscopio puede inclinarse (normalmente a lo largo de un solo eje), lo que permite la técnica de partícula única conocida como inclinación cónica aleatoria. ^{[ 8 ]} Se obtiene una imagen de un área de la muestra con una inclinación de cero grados y de ángulos elevados (~60-70 grados), o en el caso del método relacionado de reconstrucción de inclinación ortogonal, ^{[ 9 ]} +45 y −45 grados. Se seleccionan pares de partículas correspondientes al mismo objeto con dos inclinaciones diferentes (pares de inclinación), y siguiendo los parámetros utilizados en los pasos posteriores de alineación y clasificación, se puede generar una reconstrucción tridimensional con relativa facilidad. Esto se debe a que el ángulo de visión (definido como tres ángulos de Euler ) de cada partícula se conoce a partir de la geometría de inclinación.

Las reconstrucciones 3D a partir de la inclinación cónica aleatoria sufren de información faltante debido a un rango restringido de orientaciones. Conocido como el cono faltante ^{[ 10 ]} (debido a la forma en el espacio recíproco), esto causa distorsiones en los mapas 3D. Sin embargo, el problema del cono faltante a menudo se puede superar combinando varias reconstrucciones de inclinación. Los métodos de inclinación son más adecuados para muestras teñidas negativamente y pueden usarse para partículas que se adsorben a la película de soporte de carbono en orientaciones preferidas. El fenómeno conocido como carga o movimiento inducido por el haz ^{[ 11 ]} hace que la obtención de imágenes de alta inclinación de muestras en hielo vítreo sea un desafío.

Existen varios programas de software que permiten visualizar los mapas 3D. Estos suelen permitir al usuario acoplar manualmente las coordenadas de las proteínas (estructuras obtenidas mediante cristalografía de rayos X , RMN o un modelo computacional como el que se encuentra en la base de datos de estructuras de proteínas AlphaFold ) de las subunidades en la densidad electrónica. Varios programas también pueden ajustar las subunidades computacionalmente; a partir de la década de 2020, el uso de estos programas tiende a producir una mayor precisión que el acoplamiento manual porque pueden realizar tareas laboriosas como: ^{[ 12 ] [ 13 ]}

• La escala de los mapas derivados de SPA depende del conocimiento del tamaño del píxel (angstroms por píxel), que no siempre es preciso. Los programas pueden corregir automáticamente esta diferencia utilizando datos de coordenadas o el conocimiento de los enlaces químicos. ^{[ 14 ]}
• Muchas proteínas están formadas por varios dominios proteicos relativamente rígidos unidos por partes flexibles. Los datos de coordenadas preexistentes, ya sean experimentales o computacionales, pueden no coincidir exactamente con el posicionamiento entre dominios del mapa de crio-EM. Los programas modernos pueden "dividir" automáticamente los datos de coordenadas preexistentes en dominios individuales y ajustarlos individualmente. ^{[ 15 ]}

Para estructuras de mayor resolución, es posible construir la macromolécula directamente, sin conocimiento estructural previo obtenido mediante otros métodos. El método manual tradicional consiste en identificar visualmente residuos clave, generalmente aromáticos grandes, como "anclas" en la secuencia conocida de la proteína analizada. También es teóricamente posible, aunque muy difícil, hacerlo sin conocer la secuencia, leyéndola directamente. Se han desarrollado algoritmos informáticos para ambas tareas con una eficiencia y precisión sobrehumanas, ^{[ 16 ]} incluso para el caso de necesitar identificar una secuencia desconocida. ^{[ 17 ]}

Un ajuste inicial del mapa se refina iterativamente para obtener mejores resultados, definiéndose "bueno" por una combinación de la concordancia del mapa y las reglas de la geometría química. Un ajuste rígido que utiliza coordenadas proteicas preexistentes suele discrepar del mapa en cuanto a ligeras transformaciones geométricas (desplazamiento y rotación de piezas) y orientaciones de las cadenas laterales ( rotámeros ), lo cual se aborda en este paso. ^{[ 18 ]} En casos más complejos, se puede utilizar un campo de fuerza (como Rosetta y AQuaRef) para estimar la energía libre de un modelo dado, guiando la reconstrucción hacia una disposición de átomos de menor energía (más estable y más plausible). Los campos de fuerza son especialmente beneficiosos para mapas de baja resolución, donde los ajustes mejorados tienden a mostrar mejores coincidencias con modelos de mayor resolución de la misma molécula. Los campos de fuerza también son útiles para resolver interacciones no covalentes, como los enlaces de hidrógeno. ^{[ 19 ]}

Como los modelos de crio-EM de alta resolución son relativamente nuevos, las herramientas de control de calidad no son tan abundantes como para los modelos de rayos X. Sin embargo, han comenzado a aparecer versiones de crio-EM ("espacio real") del mapa de densidad diferencial , ^{[ 20 ]} validación cruzada usando un mapa "libre" (comparable al uso de un factor R libre ), ^{[ 21 ] [ 22 ]} y varias herramientas de validación de estructura .