Cromatografía de exclusión por tamaño

La cromatografía de exclusión por tamaño , también conocida como cromatografía de tamiz molecular , ^{[ 1 ]} es un método cromatográfico en el que las moléculas en solución se separan por su forma y, en algunos casos, por su tamaño . ^{[ 2 ]} Generalmente se aplica a moléculas grandes o complejos macromoleculares como proteínas y polímeros industriales . ^{[ 3 ]} Típicamente, cuando se utiliza una solución acuosa para transportar la muestra a través de la columna, la técnica se conoce como cromatografía de filtración en gel , en contraposición al nombre de cromatografía de permeación en gel , que se utiliza cuando se utiliza un disolvente orgánico como fase móvil. La columna de cromatografía está empaquetada con perlas finas y porosas que comúnmente están compuestas de polímeros de dextrano , agarosa o poliacrilamida . Los tamaños de poro de estas perlas se utilizan para estimar las dimensiones de las macromoléculas . ^{[ 1 ]} La SEC es un método de caracterización de polímeros ampliamente utilizado debido a su capacidad para proporcionar buenos resultados de distribución de masa molar (Mw) para polímeros.

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es fundamentalmente diferente de todas las demás técnicas cromatográficas, ya que la separación se basa en un procedimiento simple de clasificación de tamaños moleculares en lugar de cualquier tipo de interacción. ^{[ 4 ]}

La principal aplicación de la cromatografía de exclusión por tamaño es el fraccionamiento de proteínas y otros polímeros solubles en agua, mientras que la cromatografía de permeación en gel se utiliza para analizar la distribución del peso molecular de polímeros solubles en materia orgánica. Ninguna de estas técnicas debe confundirse con la electroforesis en gel , donde se utiliza un campo eléctrico para "atraer" moléculas a través del gel en función de sus cargas eléctricas. El tiempo que un soluto permanece dentro de un poro depende del tamaño de este. Los solutos más grandes tendrán acceso a un volumen menor y viceversa. Por lo tanto, un soluto más pequeño permanecerá dentro del poro durante un período de tiempo más prolongado en comparación con un soluto más grande. ^{[ 5 ]}

Aunque la cromatografía de exclusión por tamaño se utiliza ampliamente para estudiar materia orgánica natural, presenta limitaciones. Una de ellas es la ausencia de un marcador de peso molecular estándar; ^{[ 6 ]} por lo tanto, no hay con qué comparar los resultados. Si se requiere un peso molecular preciso, deben utilizarse otros métodos.

Las ventajas de este método incluyen una buena separación de moléculas grandes de las pequeñas con un volumen mínimo de eluido, ^{[ 7 ]} y que se pueden aplicar diversas soluciones sin interferir con el proceso de filtración, preservando al mismo tiempo la actividad biológica de las partículas a separar. La técnica se suele combinar con otras que separan aún más las moléculas según otras características, como acidez, basicidad, carga y afinidad por ciertos compuestos. Con la cromatografía de exclusión por tamaño, se obtienen tiempos de separación cortos y bien definidos, así como bandas estrechas, lo que resulta en una buena sensibilidad. Además, no hay pérdida de muestra porque los solutos no interactúan con la fase estacionaria.

Otra ventaja de este método experimental es que, en ciertos casos, es factible determinar el peso molecular aproximado de un compuesto. La forma y el tamaño del compuesto (eluente) determinan cómo interactúa con el gel (fase estacionaria). Para determinar el peso molecular aproximado, se obtienen los volúmenes de elución de los compuestos con sus pesos moleculares correspondientes y luego se realiza una gráfica de "K _av " frente a "log(Mw)", donde${\displaystyle K_{av}=(V_{e}-V_{o})/(V_{t}-V_{o})}$y Mw es la masa molecular. Esta gráfica actúa como una curva de calibración, que se utiliza para aproximar el peso molecular del compuesto deseado. El componente V _e representa el volumen en el que eluyen las moléculas intermedias, como las moléculas que tienen acceso parcial a las perlas de la columna. Además, V _t es la suma del volumen total entre las perlas y el volumen dentro de las perlas. El componente V _o representa el volumen en el que eluyen las moléculas más grandes, que eluyen al principio. ^{[ 8 ] [ 9 ]} Las desventajas son, por ejemplo, que solo se puede acomodar un número limitado de bandas porque la escala de tiempo del cromatograma es corta y, en general, debe haber una diferencia del 10 % en la masa molecular para tener una buena resolución. ^{[ 7 ]}

La técnica fue inventada en 1955 por Grant Henry Lathe y Colin R. Ruthven, quienes trabajaban en el Hospital Queen Charlotte de Londres. ^{[ 10 ] [ 11 ]} Posteriormente recibieron el Premio John Scott por esta invención. ^{[ 12 ]} Mientras que Lathe y Ruthven utilizaron geles de almidón como matriz, Jerker Porath y Per Flodin introdujeron más tarde geles de dextrano; ^{[ 13 ]} otros geles con propiedades de fraccionamiento por tamaño incluyen la agarosa y la poliacrilamida. Se ha publicado una breve revisión de estos desarrollos. ^{[ 14 ]}

También se intentó fraccionar polímeros sintéticos de alto peso molecular; sin embargo, no fue hasta 1964, cuando J.C. Moore, de la compañía Dow Chemical, publicó su trabajo sobre la preparación de columnas de cromatografía de permeación en gel (GPC) basadas en poliestireno reticulado con tamaño de poro controlado, ^{[ 15 ]} que comenzó un rápido aumento de la actividad investigadora en este campo. Se reconoció casi de inmediato que, con la calibración adecuada, la GPC era capaz de proporcionar información sobre la masa molar y la distribución de masa molar de los polímeros sintéticos. Dado que esta última información era difícil de obtener mediante otros métodos, la GPC se generalizó rápidamente. ^{[ 16 ]}

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se utiliza principalmente para el análisis de moléculas grandes, como proteínas o polímeros. La SEC funciona atrapando moléculas más pequeñas en los poros del adsorbente ("fase estacionaria"). Este proceso se realiza generalmente dentro de una columna, que normalmente consiste en un tubo hueco densamente empaquetado con microesferas de polímero que contienen poros de diferentes tamaños. Estos poros pueden ser depresiones en la superficie o canales a través de la microesfera. A medida que la solución avanza por la columna, algunas partículas entran en los poros. Las partículas más grandes no pueden entrar en tantos poros. Cuanto mayores son las partículas, más rápida es la elución. Las moléculas más grandes simplemente pasan de largo por los poros porque son demasiado grandes para entrar en ellos. Por lo tanto, las moléculas más grandes fluyen a través de la columna más rápidamente que las más pequeñas; es decir, cuanto más pequeña es la molécula, mayor es el tiempo de retención.

Un requisito para la SEC es que el analito no interactúe con la superficie de las fases estacionarias, y que las diferencias en el tiempo de elución entre los analitos se basen idealmente solo en el volumen de soluto al que pueden acceder, en lugar de en interacciones químicas o electrostáticas con las fases estacionarias. Así, una molécula pequeña que puede penetrar en todas las regiones del sistema de poros de la fase estacionaria puede acceder a un volumen total igual a la suma del volumen total de los poros y el volumen interparticular. Esta molécula pequeña eluye tarde (después de haber penetrado en todo el volumen de los poros y el volumen interparticular, aproximadamente el 80 % del volumen de la columna). En el otro extremo, una molécula muy grande que no puede penetrar en ninguno de los poros más pequeños solo puede acceder al volumen interparticular (~35 % del volumen de la columna) y eluye antes, cuando este volumen de fase móvil ha pasado a través de la columna. El principio fundamental de la SEC es que las partículas de diferentes tamaños eluyen (filtran) a través de una fase estacionaria a diferentes velocidades. Esto da como resultado la separación de una solución de partículas en función de su tamaño. Siempre que todas las partículas se carguen simultáneamente o casi simultáneamente, las partículas del mismo tamaño deberían eluir juntas.

Sin embargo, dado que existen diversas medidas del tamaño de una macromolécula (por ejemplo, el radio de giro y el radio hidrodinámico), un problema fundamental en la teoría de la SEC ha sido la elección de un parámetro de tamaño molecular adecuado para separar moléculas de distintos tipos. Experimentalmente, Benoit y colaboradores hallaron una excelente correlación entre el volumen de elución y un tamaño molecular basado en la dinámica, el volumen hidrodinámico , para diversas arquitecturas de cadena y composiciones químicas. ^{[ 17 ]} La correlación observada, basada en el volumen hidrodinámico, se aceptó como la base de la calibración universal de la SEC.

Sin embargo, el uso del volumen hidrodinámico, un tamaño basado en propiedades dinámicas, en la interpretación de datos SEC no se comprende completamente. ^{[ 18 ]} Esto se debe a que SEC se suele realizar en condiciones de bajo caudal donde el factor hidrodinámico debería tener poco efecto en la separación. De hecho, tanto la teoría como las simulaciones por computadora asumen un principio de separación termodinámica: el proceso de separación está determinado por la distribución de equilibrio (partición) de macromoléculas de soluto entre dos fases: una fase de solución diluida a granel ubicada en el espacio intersticial y fases de solución confinadas dentro de los poros del material de relleno de la columna. Basándose en esta teoría, se ha demostrado que el parámetro de tamaño relevante para la partición de polímeros en poros es la dimensión de extensión media (proyección máxima media sobre una línea). ^{[ 19 ]} Aunque este problema no se ha resuelto completamente, es probable que la dimensión de extensión media y el volumen hidrodinámico estén fuertemente correlacionados.

Cada columna de exclusión por tamaño tiene un rango de pesos moleculares que puede separar. El límite de exclusión define el peso molecular en el extremo superior del rango de trabajo de la columna, donde las moléculas son demasiado grandes para quedar atrapadas en la fase estacionaria. El extremo inferior del rango está definido por el límite de permeación, que define el peso molecular de una molécula lo suficientemente pequeña como para penetrar todos los poros de la fase estacionaria. Todas las moléculas por debajo de esta masa molecular son tan pequeñas que eluyen como una sola banda. ^{[ 7 ]}

La solución filtrada que se recoge al final se conoce como eluido . El volumen muerto incluye cualquier partícula demasiado grande para entrar en el medio, y el volumen del disolvente se conoce como volumen de la columna .

A continuación se muestran los materiales que se utilizan comúnmente para perlas de gel porosas en cromatografía de exclusión por tamaño ^{[ 20 ].}

En situaciones reales, las partículas en solución no tienen un tamaño fijo, lo que aumenta la probabilidad de que una partícula que de otro modo se vería obstaculizada por un poro pase justo a su lado. Además, las partículas de la fase estacionaria no están definidas de forma ideal; tanto las partículas como los poros pueden variar de tamaño. Por lo tanto, las curvas de elución se asemejan a distribuciones gaussianas . La fase estacionaria también puede interactuar de forma indeseable con una partícula e influir en los tiempos de retención, aunque los fabricantes de columnas se esmeran en utilizar fases estacionarias inertes que minimicen este problema.

Al igual que en otras técnicas de cromatografía, aumentar la longitud de la columna mejora la resolución, y aumentar su diámetro incrementa su capacidad. Un empaquetamiento adecuado de la columna es fundamental para obtener la máxima resolución: una columna con exceso de material puede colapsar los poros de las perlas, lo que provoca una pérdida de resolución. Una columna con poco material puede reducir la superficie relativa de la fase estacionaria accesible a las especies más pequeñas, lo que hace que estas permanezcan menos tiempo atrapadas en los poros. A diferencia de las técnicas de cromatografía de afinidad, una cabeza de disolvente en la parte superior de la columna puede disminuir drásticamente la resolución, ya que la muestra se difunde antes de la carga, ampliando la elución posterior.

En las columnas manuales sencillas, el eluyente se recoge en volúmenes constantes, denominados fracciones. Cuanto más similares sean las partículas en tamaño, mayor será la probabilidad de que se encuentren en la misma fracción y no se detecten por separado. Las columnas más avanzadas superan este problema mediante el monitoreo constante del eluyente.

Las fracciones recolectadas suelen analizarse mediante técnicas espectroscópicas para determinar la concentración de las partículas eluidas. Las técnicas de detección espectroscópica más comunes son el índice de refracción (IR) y la radiación ultravioleta (UV). Al eluir especies espectroscópicamente similares (como durante la purificación biológica), pueden ser necesarias otras técnicas para identificar el contenido de cada fracción. También es posible analizar el flujo del eluyente de forma continua mediante IR, LALLS , dispersión de luz láser multiángulo ( MALS), UV y/o mediciones de viscosidad.

El volumen de elución (Ve) disminuye aproximadamente de forma lineal con el logaritmo del volumen hidrodinámico molecular . Las columnas suelen calibrarse utilizando 4-5 muestras estándar (p. ej., proteínas plegadas de peso molecular conocido) y una muestra que contiene una molécula muy grande, como la tiroglobulina, para determinar el volumen muerto . (No se recomienda el dextrano azul para la determinación de Vo porque es heterogéneo y puede dar resultados variables). Los volúmenes de elución de los estándares se dividen por el volumen de elución de la tiroglobulina (Ve/Vo) y se representan gráficamente frente al logaritmo de los pesos moleculares de los estándares.

En SEC, no se mide tanto la masa como el volumen hidrodinámico. El peso molecular se puede aproximar a partir de los datos de SEC mediante la relación entre el peso molecular y el volumen hidrodinámico para estándares de poliestireno. ^{[ 24 ]} Otro inconveniente es la posibilidad de interacción entre la fase estacionaria y el analito. Cualquier interacción conlleva un tiempo de elución posterior y, por lo tanto, simula un tamaño de analito menor.

El ensanchamiento de banda se produce por turbulencia, difusión térmica y fricción . Las bandas también se superponen entre sí. Como resultado, el eluyente suele diluirse considerablemente. Se pueden tomar algunas precauciones para evitar el ensanchamiento de banda. Por ejemplo, se puede aplicar la muestra en una banda estrecha y altamente concentrada en la parte superior de la columna. Cuanto más concentrado esté el eluyente, más eficiente será el procedimiento. ^{[ 9 ]}

La cromatografía de exclusión por tamaño absoluta (ASEC) es una técnica que acopla un instrumento de dispersión de luz, generalmente dispersión de luz multiángulo (MALS) u otra forma de dispersión de luz estática (SLS), pero posiblemente un instrumento de dispersión de luz dinámica (DLS), a un sistema de cromatografía de exclusión por tamaño para mediciones absolutas de masa molar y/o tamaño de proteínas y macromoléculas a medida que eluyen del sistema de cromatografía. ^{[ 25 ]}

La definición de "absoluto" en este caso es que no se requiere la calibración del tiempo de retención en la columna con un conjunto de estándares de referencia para obtener la masa molar o el tamaño hidrodinámico, a menudo denominado diámetro hidrodinámico (D _H en unidades de nm). Las interacciones no ideales de la columna, como las interacciones electrostáticas o hidrofóbicas de la superficie que modulan el tiempo de retención en relación con los estándares, no afectan el resultado final. Del mismo modo, las diferencias entre la conformación del analito y el estándar no tienen efecto en una medición absoluta; por ejemplo, con el análisis MALS, la masa molar de las proteínas inherentemente desordenadas se caracteriza con precisión aunque eluyen en tiempos mucho más tempranos que las proteínas globulares con la misma masa molar, y lo mismo ocurre con los polímeros ramificados que eluyen más tarde en comparación con los estándares de referencia lineales con la misma masa molar. ^{[ 25 ] [ 26 ] [ 27 ]} Otro beneficio de ASEC es que la masa molar y/o el tamaño se determinan en cada punto de un pico de elución y, por lo tanto, indican homogeneidad o polidispersidad dentro del pico. Por ejemplo, el análisis SEC-MALS de una proteína monodispersa mostrará que todo el pico está formado por moléculas con la misma masa molar, algo que no es posible con el análisis SEC estándar.

La determinación de la masa molar mediante SLS requiere combinar las mediciones de dispersión de luz con las de concentración. Por lo tanto, SEC-MALS suele incluir un detector de dispersión de luz y un refractómetro diferencial o un detector de absorbancia UV/Vis. Además, MALS determina el radio cuadrático medio R _g de moléculas con un tamaño superior a un límite determinado, normalmente 10  nm. De este modo, SEC-MALS puede analizar la conformación de polímeros mediante la relación entre la masa molar y R _g . Para moléculas más pequeñas, se añade DLS o, más comúnmente, un viscosímetro diferencial para determinar el radio hidrodinámico y evaluar la conformación molecular de la misma manera.

En SEC-DLS, el tamaño de las macromoléculas se mide a medida que eluyen en la celda de flujo del instrumento DLS desde el conjunto de columnas de exclusión por tamaño. Se mide el tamaño hidrodinámico de las moléculas o partículas, no su peso molecular. Para las proteínas, se puede utilizar un cálculo tipo Mark-Houwink para estimar el peso molecular a partir del tamaño hidrodinámico.

Una ventaja importante de DLS acoplado con SEC es la capacidad de obtener una resolución DLS mejorada. ^{[ 28 ]} DLS por lotes es rápido y simple y proporciona una medida directa del tamaño promedio, pero la resolución de base de DLS es una relación de 3:1 en diámetro. Usando SEC, las proteínas y los oligómeros de proteínas se separan, lo que permite la resolución oligomérica. Los estudios de agregación también se pueden hacer usando ASEC. Aunque la concentración de agregados puede no calcularse con dispersión de luz (un detector de concentración en línea como el que se usa en SEC-MALS para la medición de masa molar también determina la concentración de agregados), el tamaño del agregado se puede medir, limitado solo por el tamaño máximo que eluye de las columnas SEC.

Las limitaciones de ASEC con detección DLS incluyen el caudal, la concentración y la precisión. Dado que la función de correlación requiere entre 3 y 7 segundos para su correcta construcción, se puede recopilar un número limitado de puntos de datos en el pico. ASEC con detección SLS no está limitada por el caudal y el tiempo de medición es prácticamente instantáneo; además, el rango de concentración es varios órdenes de magnitud mayor que el de DLS. Sin embargo, el análisis de masa molar con SEC-MALS requiere mediciones de concentración precisas. Los detectores MALS y DLS suelen combinarse en un solo instrumento para un análisis absoluto más completo tras la separación por SEC.

• PEGilación
• Cromatografía de permeación en gel
• purificación de proteínas