Tinción

La mayoría de los colorantes comúnmente utilizados en microscopía están disponibles como colorantes certificados por la BSC . Esto significa que muestras del lote del fabricante han sido analizadas por un organismo independiente, la Comisión de Colorantes Biológicos ( BSC ), y se ha comprobado que cumplen o superan ciertos estándares de pureza, contenido de colorante y rendimiento en técnicas de tinción, lo que garantiza experimentos más precisos y resultados más fiables. Estos estándares se publican en la revista de la comisión, Biotechnic & Histochemistry . ^{[ 3 ]} Muchos colorantes presentan inconsistencias en su composición entre diferentes proveedores. El uso de colorantes certificados por la BSC elimina una fuente de resultados inesperados. ^{[ 4 ]}

Algunos vendedores comercializan tinciones "certificadas" por ellos mismos en lugar de por la Comisión de Tinción Biológica. Dichos productos pueden o no ser adecuados para diagnóstico y otras aplicaciones. ^{[ 5 ]}

Un método de tinción simple para bacterias que suele ser eficaz, incluso cuando fallan los métodos de tinción positiva , es la tinción negativa . Esto se logra extendiendo la muestra sobre el portaobjetos y aplicando nigrosina (un colorante sintético negro) o tinta china (una suspensión acuosa de partículas de carbono). Tras el secado, los microorganismos se pueden observar en microscopía de campo claro como inclusiones más claras que contrastan bien con el entorno oscuro que las rodea. ^{[ 6 ]} La tinción negativa tiñe el fondo en lugar de los organismos porque la pared celular de los microorganismos suele tener una carga negativa que repele el colorante con carga negativa. Los colorantes utilizados en la tinción negativa son ácidos. ^{[ 1 ]} Nota: la tinción negativa es una técnica suave que puede no destruir los microorganismos y, por lo tanto, no es adecuada para el estudio de patógenos.

A diferencia de la tinción negativa, la tinción positiva utiliza colorantes básicos para teñir la muestra sobre un fondo brillante. Si bien el cromóforo se utiliza tanto en la tinción negativa como en la positiva, en esta técnica se emplea un ion con carga positiva en lugar de uno con carga negativa. La pared celular con carga negativa de muchos microorganismos atrae al cromóforo con carga positiva, lo que provoca que la muestra absorba el colorante, adquiriendo así el color del mismo. La tinción positiva se utiliza con mayor frecuencia que la negativa en microbiología. A continuación se enumeran los diferentes tipos de tinción positiva. ^{[ 1 ]}

La tinción simple es una técnica que utiliza un solo tipo de tinción en cada portaobjetos. Debido a que solo se utiliza una tinción, las muestras (para tinciones positivas) o el fondo (para tinciones negativas) tendrán un solo color. Por lo tanto, las tinciones simples se utilizan generalmente para observar un solo organismo por portaobjetos. La tinción diferencial utiliza múltiples tinciones por portaobjetos. Según las tinciones utilizadas, los organismos con diferentes propiedades aparecerán con distintos colores, lo que permite clasificar múltiples muestras. La tinción diferencial también se puede utilizar para colorear diferentes orgánulos dentro de un mismo organismo, como se observa en la tinción de endosporas . ^{[ 1 ]}

La tinción de Gram se utiliza para determinar el estado grampositivo y clasificar las bacterias en función de la composición de su pared celular . Esta tinción emplea cristal violeta para teñir las paredes celulares, yodo (como mordiente) y una contratinción con fucsina o safranina (para marcar todas las bacterias). El estado grampositivo ayuda a dividir las muestras bacterianas en dos grupos, generalmente representativos de su filogenia subyacente. Esta característica, en combinación con otras técnicas, la convierte en una herramienta útil en los laboratorios de microbiología clínica, donde puede ser importante para la selección temprana de antibióticos apropiados . ^{[ 8 ]}

En la mayoría de las preparaciones teñidas con Gram, los organismos Gram negativos aparecen rojos o rosados ​​debido a la contratinción. Debido a la mayor cantidad de lípidos, tras el tratamiento con alcohol, la porosidad de la pared celular aumenta, permitiendo el paso del complejo CVI (cristal violeta-yodo). Por lo tanto, la tinción primaria no se retiene. Además, a diferencia de la mayoría de las bacterias Gram positivas, las bacterias Gram negativas poseen pocas capas de peptidoglicano y una membrana celular secundaria compuesta principalmente de lipopolisacárido.

La tinción de endosporas se utiliza para identificar la presencia o ausencia de endosporas , que dificultan enormemente la eliminación de bacterias. Las esporas bacterianas han demostrado ser difíciles de teñir, ya que no son permeables a los reactivos de tinción acuosos. La tinción de endosporas es particularmente útil para identificar patógenos bacterianos formadores de endosporas , como Clostridioides difficile . Antes del desarrollo de métodos más eficientes, esta tinción se realizaba mediante el método de Wirtz con fijación por calor y contratinción. El uso de verde malaquita y una proporción diluida de fucsina fenicada, junto con ácido ósmico, era una excelente manera de asegurar que no se mezclaran los colorantes. Sin embargo, los métodos de tinción recientemente revisados ​​han reducido significativamente el tiempo necesario para crear estas tinciones. Esta revisión incluyó la sustitución de la fucsina fenicada por safranina acuosa junto con una fórmula diluida al 5 % de verde malaquita. Esta nueva y mejorada composición de tinciones se realizó de la misma manera que antes, utilizando fijación por calor, enjuague y secado con papel absorbente para su posterior examen. Tras el examen, todas las bacterias formadoras de endosporas se teñirán de verde, mientras que todas las demás células aparecerán rojas. ^{[ 9 ]}

La tinción de Ziehl-Neelsen es una tinción ácido-resistente que se utiliza para teñir especies de Mycobacterium tuberculosis que no se tiñen con los procedimientos de tinción de laboratorio estándar, como la tinción de Gram.

Esta tinción se realiza mediante el uso de fucsina fenicada de color rojo , que tiñe las bacterias, y un colorante de contraste como el azul de metileno .

La tinción con hematoxilina y eosina se utiliza frecuentemente en histología para examinar secciones delgadas de tejido. ^{[ 10 ]} La hematoxilina tiñe los núcleos celulares de azul, mientras que la eosina tiñe el citoplasma, el tejido conectivo y otras sustancias extracelulares de rosa o rojo. ^{[ 10 ]} La eosina es fuertemente absorbida por los glóbulos rojos , tiñéndolos de rojo brillante. En una preparación de H&E realizada con destreza, los glóbulos rojos son casi naranjas, y el colágeno y el citoplasma (especialmente el muscular) adquieren diferentes tonalidades de rosa.

La tinción de Papanicolaou , o tinción PAP, se desarrolló para reemplazar la citología por aspiración con aguja fina (CAAF) con la esperanza de disminuir los tiempos y costos de tinción sin comprometer la calidad. Esta tinción es un método de uso frecuente para examinar muestras celulares de diversos tipos de tejido en diferentes órganos. La tinción PAP ha experimentado varias modificaciones para convertirse en una alternativa viable a la CAAF. Esta transición surgió de la valoración que los científicos dieron a las extensiones fijadas en húmedo, ya que preservaban las estructuras de los núcleos, en contraste con la apariencia opaca de las extensiones de Romanowsky secadas al aire. Esto condujo a la creación de una tinción híbrida de fijación en húmedo y secado al aire, conocida como tinción ultrarrápida de Papanicolaou. Esta modificación incluye el uso de solución salina nasal para rehidratar las células y aumentar su transparencia, y se combina con el uso de formalina alcohólica para realzar los colores de los núcleos. La tinción de Papanicolaou se utiliza actualmente en lugar de la tinción citológica en todos los tipos de órganos debido a su mayor calidad morfológica, la reducción del tiempo de tinción y la disminución de los costos. Se utiliza frecuentemente para teñir muestras de frotis de Papanicolaou . ^{[ 11 ]} Utiliza una combinación de hematoxilina , naranja G , eosina Y , verde claro SF amarillento y, a veces, marrón Bismarck Y. ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]}

^{[ 13 ]} El ácido peryódico de Schiff (PAS)es una tinción especial de histología que se utiliza para marcarcarbohidratos(glucógeno,glicoproteínas,proteoglicanos). El PAS se usa comúnmente en tejido hepático donde se forman depósitos de glucógeno, lo cual se hace para distinguir diferentes tipos de enfermedades de almacenamiento de glucógeno. El PAS es importante porque puede detectar gránulos de glucógeno que se encuentran en tumores de los ovarios y el páncreas del sistema endocrino, así como en la vejiga y los riñones del sistema renal. Las membranas basales también pueden aparecer en una tinción PAS y pueden ser importantes para el diagnóstico de enfermedades renales. Debido al alto volumen de carbohidratos dentro de la pared celular de las hifas y levaduras de los hongos, la tinción de ácido peryódico de Schiff puede ayudar a localizar estas especies dentro de muestras de tejido del cuerpo humano.

La tinción tricrómica de Masson es (como su nombre indica) un protocolo de tinción de tres colores. La receta ha evolucionado a partir de la técnica original de Masson para diferentes aplicaciones específicas, pero todas son adecuadas para distinguir las células del tejido conectivo circundante . La mayoría de las recetas producen queratina y fibras musculares rojas, colágeno y hueso con tinción azul o verde , citoplasma con tinción rojo claro o rosa , y núcleos celulares negros .

La tinción de Romanowsky se considera un efecto de tinción policromático y se basa en una combinación de eosina plus ( eosina químicamente reducida ) y azul de metileno desmetilado (que contiene sus productos de oxidación, azur A y azur B ). Esta tinción desarrolla diferentes colores para todas las estructuras celulares ("efecto Romanowsky-Giemsa") y, por lo tanto, se utilizó para teñir polimorfonucleares de neutrófilos y núcleos celulares. Las variantes comunes incluyen la tinción de Wright , la tinción de Jenner , la tinción de May-Grünwald, la tinción de Leishman y la tinción de Giemsa .

Todas se utilizan para examinar muestras de sangre o médula ósea . Se prefieren a la tinción H&E para la inspección de células sanguíneas porque permiten distinguir fácilmente los diferentes tipos de leucocitos (glóbulos blancos). Todas también son adecuadas para el examen de la sangre con el fin de detectar parásitos transmitidos por la sangre, como la malaria . ^{[ 14 ]}

La tinción con plata consiste en el uso de plata para teñir secciones histológicas . Este tipo de tinción es importante para la visualización de proteínas (por ejemplo, colágeno tipo III ) y ADN . Se utiliza para mostrar sustancias tanto dentro como fuera de las células . La tinción con plata también se utiliza en la electroforesis en gel con gradiente de temperatura .

Las células argentafines reducen la solución de plata a plata metálica tras la fijación con formalina . Este método fue descubierto por el italiano Camillo Golgi , mediante una reacción entre nitrato de plata y dicromato de potasio , precipitando así cromato de plata en algunas células (véase el método de Golgi ). Las células girófilas reducen la solución de plata a plata metálica tras exponerse a un colorante que contiene un agente reductor . Un ejemplo de ello sería la hidroquinona o la formalina.

La tinción de Sudán utiliza colorantes Sudán para teñir sustancias sudanófilas, que a menudo incluyen lípidos . Se suelen utilizar Sudán III , Sudán IV , Rojo Óleo O , tetróxido de osmio y Negro Sudán B. La tinción de Sudán se utiliza frecuentemente para determinar el nivel de grasa fecal en el diagnóstico de la esteatorrea .

La tinción de Wirtz-Conklin es una técnica especial diseñada para teñir endosporas verdaderas utilizando verde malaquita como colorante primario y safranina como colorante de contraste. Una vez teñidas, no se decoloran. La aplicación de calor durante el proceso de tinción es un factor determinante. ^{[ 15 ]} El calor ayuda a abrir la membrana de la espora para que el colorante pueda penetrar. El objetivo principal de esta tinción es mostrar la germinación de las esporas bacterianas. Si se produce la germinación, la espora se tornará verde debido al verde malaquita y la célula circundante se tornará roja por la safranina. Esta tinción también puede ayudar a determinar la orientación de la espora dentro de la célula bacteriana; si es terminal (en el extremo), subterminal (dentro de la célula) o central (completamente en el centro de la célula).

La tinción con péptidos hibridantes de colágeno (CHP) permite teñir de forma sencilla y directa colágenos desnaturalizados de cualquier tipo (tipo I, II, IV, etc.), independientemente de si han sufrido daños o degradación por medios enzimáticos, mecánicos, químicos o térmicos. Estos péptidos actúan replegándose en la triple hélice de colágeno con las hebras simples disponibles en el tejido. Los CHP pueden visualizarse mediante un microscopio de fluorescencia .

La naranja de acridina (AO) es un colorante catiónico fluorescente selectivo para ácidos nucleicos, útil para la determinación del ciclo celular. Es permeable a la célula e interactúa con el ADN y el ARN mediante intercalación o atracciones electrostáticas. Cuando se une al ADN, su espectro es muy similar al de la fluoresceína. Al igual que la fluoresceína, también es útil como tinción no específica para retroiluminar células teñidas convencionalmente en la superficie de una muestra sólida de tejido (tinción por retroiluminación fluorescente ^{[ 16 ]} ).

^{[ 17 ]} El marrón de Bismarck(también conocido como marrón de Bismarck Y o marrón de Manchester) confiere un color amarillo alas mucinas Para que sea útil,debe combinarse con otras tinciones

El carmín es un colorante rojo intenso que se utiliza para teñir el glucógeno , mientras que el carmín de alumbre es un colorante nuclear. Las tinciones con carmín requieren el uso de un mordiente, generalmente aluminio .

El azul brillante de Coomassie tiñe las proteínas de un intenso color azul de forma inespecífica. Se utiliza frecuentemente en electroforesis en gel.

El violeta de cresilo tiñe de color violeta los componentes ácidos del citoplasma neuronal, en concreto los cuerpos de Nissl . Se utiliza con frecuencia en la investigación cerebral.

El violeta cristal , al combinarse con un mordiente adecuado, tiñe de púrpura las paredes celulares . El violeta cristal es el colorante utilizado en la tinción de Gram.

DAPI es un colorante nuclear fluorescente que se excita con luz ultravioleta y muestra una fuerte fluorescencia azul al unirse al ADN . DAPI se une a las repeticiones ricas en A=T de los cromosomas. DAPI tampoco es visible con la microscopía de transmisión convencional. Puede utilizarse en células vivas o fijas. Las células teñidas con DAPI son especialmente adecuadas para el recuento celular. ^{[ 18 ]}

La eosina se usa con mayor frecuencia como colorante de contraste para la hematoxilina, impartiendo un color rosa o rojo al material citoplasmático , las membranas celulares y algunas estructuras extracelulares. También imparte un color rojo intenso a los glóbulos rojos . La eosina también puede usarse como colorante de contraste en algunas variantes de la tinción de Gram y en muchos otros protocolos. En realidad, existen dos compuestos muy similares que comúnmente se denominan eosina. El más utilizado es la eosina Y (también conocida como eosina Y ws o eosina amarillenta); tiene un tono ligeramente amarillento. El otro compuesto de eosina es la eosina B (eosina azulada o rojo imperial); tiene un tono azulado muy tenue. Los dos colorantes son intercambiables, y el uso de uno u otro es más una cuestión de preferencia y tradición.

El bromuro de etidio se intercala y tiñe el ADN, produciendo una tinción fluorescente rojo-anaranjada. Si bien no tiñe las células sanas, puede utilizarse para identificar células en las etapas finales de la apoptosis , ya que estas células poseen membranas mucho más permeables . Por consiguiente, el bromuro de etidio se usa frecuentemente como marcador de apoptosis en poblaciones celulares y para localizar bandas de ADN en electroforesis en gel . Esta tinción también puede utilizarse junto con naranja de acridina (AO) para el recuento de células viables. Esta tinción combinada de EB/AO produce fluorescencia verde en las células vivas, mientras que las células apoptóticas conservan la característica fluorescencia rojo-anaranjada.

La fucsina ácida se puede usar para teñir colágeno, músculo liso o mitocondrias . Se utiliza como tinción nuclear y citoplasmática en el método tricrómico de Mallory. En algunas variantes del tricrómico de Masson, la fucsina ácida tiñe el citoplasma. En la picrofucsina de Van Gieson, la fucsina ácida confiere su color rojo a las fibras de colágeno. La fucsina ácida también es una tinción tradicional para mitocondrias (método de Altmann).

La hematoxilina (hematoxilina en Norteamérica) es un colorante nuclear. ^{[ 10 ]} Utilizada con un mordiente, la hematoxilina tiñe los núcleos de azul-violeta o marrón. ^{[ 10 ]} Se usa con mayor frecuencia con eosina en la tinción H&E (hematoxilina y eosina), uno de los procedimientos más comunes en histología . ^{[ 10 ]}

Hoechst es un compuesto derivado del bis -bencimidazol que se une al surco menor del ADN . Se utiliza frecuentemente en microscopía de fluorescencia para la tinción de ADN. Las tinciones de Hoechst aparecen amarillas al disolverse en soluciones acuosas y emiten luz azul bajo excitación UV. Existen dos tipos principales de Hoechst : Hoechst 33258 y Hoechst 33342. Ambos compuestos son funcionalmente similares, pero con una ligera diferencia estructural. Hoechst 33258 contiene un grupo hidroxilo terminal , lo que lo hace más soluble en solución acuosa; sin embargo, esta característica reduce su capacidad para penetrar la membrana plasmática . Hoechst 33342 contiene una sustitución etilo en el grupo hidroxilo terminal (es decir, un grupo etiléter), lo que lo hace más hidrofóbico y facilita su paso a través de la membrana plasmática .

El yodo se utiliza en química como indicador de almidón . Al mezclar almidón con yodo en solución, se desarrolla un color azul oscuro intenso, que representa un complejo almidón/yodo. El almidón es una sustancia común a la mayoría de las células vegetales, por lo que una solución diluida de yodo lo tiñe. El yodo es un componente de la tinción de Gram , una técnica utilizada en microbiología . Como mordiente en la tinción de Gram, el yodo facilita la penetración del colorante a través de los poros de la pared celular o membrana.

La solución de Lugol o yodo de Lugol (IKI) es una solución marrón que se vuelve negra en presencia de almidones y puede utilizarse como tinte celular, haciendo que los núcleos celulares sean más visibles.

La solución de Lugol, preparada con vinagre común (ácido acético), se utiliza para identificar cambios precancerosos y cancerosos en los tejidos cervicales y vaginales durante los exámenes de seguimiento de la prueba de Papanicolaou, como preparación para la biopsia. El ácido acético provoca que las células anormales se vuelvan blancas, mientras que los tejidos normales se tiñen de color marrón caoba debido al yodo. ^{[ 19 ]}

El verde malaquita (también conocido como verde diamante B o verde victoria B) se puede utilizar como colorante de contraste azul verdoso para la safranina en la técnica de tinción de Giménez para bacterias. También se puede utilizar para teñir directamente las esporas .

El verde de metilo se usa comúnmente con microscopios de campo claro, así como con microscopios de fluorescencia ^{[ 20 ]} para teñir la cromatina de las células para que sean más fáciles de ver.

Methylene blue is used to stain animal cells, such as human cheek cells, to make their nuclei more observable. Also used to stain blood films in cytology.

Neutral red (or toluylene red) stains Nissl substance red. It is usually used as a counterstain in combination with other dyes.

Nile blue (or Nile blue A) stains nuclei blue. It may be used with living cells.

Nile red (also known as Nile blue oxazone) is formed by boiling Nile blue with sulfuric acid. This produces a mix of Nile red and Nile blue. Nile red is a lipophilic stain; it will accumulate in lipid globules inside cells, staining them red. Nile red can be used with living cells. It fluoresces strongly when partitioned into lipids, but practically not at all in aqueous solution.

Osmium tetraoxide is used in optical microscopy to stain lipids. It dissolves in fats, and is reduced by organic materials to elemental osmium, an easily visible black substance.

Propidium iodide is a fluorescent intercalating agent that can be used to stain cells. Propidium iodide is used as a DNA stain in flow cytometry to evaluate cell viability or DNA content in cell cycle analysis, or in microscopy to visualise the nucleus and other DNA-containing organelles. Propidium Iodide cannot cross the membrane of live cells, making it useful to differentiate necrotic, apoptotic and healthy cells. PI also binds to RNA, necessitating treatment with nucleases to distinguish between RNA and DNA staining

Rhodamine is a protein specific fluorescent stain commonly used in fluorescence microscopy.

Safranine (or Safranine O) is a red cationic dye. It binds to nuclei (DNA) and other tissue polyanions, including glycosaminoglycans in cartilage and mast cells, and components of lignin and plastids in plant tissues.^[21] Safranine should not be confused with saffron, an expensive natural dye that is used in some methods to impart a yellow colour to collagen, to contrast with blue and red colours imparted by other dyes to nuclei and cytoplasm in animal (including human) tissues.

The incorrect spelling "safranin" is in common use. The -ine ending is appropriate for safranine O because this dye is an amine.^[4][22][23]

Los derivados del naranja de tiazol, como SYBR Safe , SYBR Green , SYBR Gold , Pico Green, SYTO-16, SYTO-9 y TOPhBu, son colorantes de cianina especiales que se utilizan comúnmente como sensores fluorescentes de ADN. La capacidad de estos colorantes para detectar ADN a bajas concentraciones se evaluó mediante dos parámetros: el aumento absoluto de la fluorescencia (AFE) y el aumento relativo de la fluorescencia (RFE). ^{[ 24 ]}

^{[ 31 ]} El ácido fosfotúngsticoes unatinción negativaparavirus,nervios,polisacáridosy otros tejidos biológicos. Se utiliza principalmente en una solución con un pH de 0,5-2%, lo que la hace neutra, y se combina con agua para formar una solución acuosa. El ácido fosfotúngstico contiene materia electrodensa que tiñe el fondo que rodea la muestra de oscuro y la muestra misma de claro. Este proceso no es la técnica positiva habitual para tinción, donde la muestra se oscurece y el fondo permanece claro.

El tetróxido de osmio se utiliza en microscopía óptica para teñir lípidos . Se disuelve en grasas y se reduce por la acción de materiales orgánicos a osmio elemental, una sustancia negra fácilmente visible. Debido a que es un metal pesado que absorbe electrones, es quizás el colorante más común utilizado para el estudio de la morfología en microscopía electrónica biológica. También se utiliza para teñir diversos polímeros para el estudio de su morfología mediante TEM. OsO_{El compuesto 4} es muy volátil y extremadamente tóxico. Es un potente agente oxidante, ya que el osmio tiene un número de oxidación de +8. Oxida agresivamente muchos materiales, dejando tras de sí un depósito de osmio no volátil en un estado de oxidación inferior.

El tetróxido de rutenio es igual de volátil e incluso más agresivo que el tetróxido de osmio, y es capaz de manchar incluso materiales que resisten la tinción con osmio, como por ejemplo el polietileno.

Otros productos químicos utilizados en la tinción para microscopía electrónica incluyen: molibdato de amonio , yoduro de cadmio , carbohidrazida , cloruro férrico , hexamina , tricloruro de indio , nitrato de lantano(III) , acetato de plomo , citrato de plomo , nitrato de plomo(II) , ácido periódico , ácido fosfomolíbdico , ferricianuro de potasio , ferrocianuro de potasio , rojo de rutenio , nitrato de plata , proteinato de plata , cloroaurato de sodio , nitrato de talio , tiosemicarbazida , acetato de uranilo , nitrato de uranilo y sulfato de vanadilo .