Estrías (microbiología)

En microbiología , la siembra por estrías es una técnica mecánica utilizada para aislar una cepa pura de una sola especie de microorganismo, a menudo bacterias . ^{[ 1 ]} Se toman muestras de una colonia derivada de una sola célula de la placa sembrada para crear un cultivo microbiológico genéticamente idéntico que se cultiva en una nueva placa para que el organismo pueda ser identificado, estudiado o analizado. ^{[ 2 ]} Se pueden utilizar diferentes patrones para sembrar una placa. Todos implican la dilución de bacterias mediante su siembra sistemática por estrías sobre la superficie exterior del agar en una placa de Petri para obtener colonias aisladas que contienen progresivamente menos células. ^{[ 1 ]} Si en la superficie del agar crecen microorganismos que son todos genéticamente iguales, el cultivo se considera entonces un cultivo microbiológico puro. Aunque la siembra manual por estrías es una habilidad fundamental, los laboratorios están empezando a adoptar sistemas de siembra por estrías automatizados para mejorar la eficiencia y la consistencia ^{[ 3 ]} .

El método moderno de siembra por estrías se desarrolló en la década de 1880 gracias a los esfuerzos de Robert Koch y otros microbiólogos para obtener cultivos microbiológicos de bacterias con el fin de estudiarlas. ^{[ 4 ]} Antes de la adopción de la siembra por estrías, las placas de vertido eran la técnica común utilizada por los microbiólogos para obtener cepas puras . ^{[ 5 ]} El método de dilución o aislamiento por estrías fue desarrollado por primera vez en el laboratorio de Koch por sus dos asistentes, Friedrick Loeffler y Georg Theodor August Gaffky . ^{[ 5 ]}

La siembra por estrías es un proceso rápido y sencillo de aislamiento de microbios mediante dilución consecutiva. La técnica se realiza reduciendo una concentración relativamente alta de bacterias a una concentración menor. La disminución de la concentración bacteriana debería dispersar suficientemente las colonias y permitir la separación de los diferentes tipos de microbios en una muestra. ^{[ 1 ]} La siembra por estrías se realiza utilizando una herramienta estéril y una técnica aséptica , como un hisopo de algodón o, comúnmente, un asa de siembra . Si se utiliza un asa de siembra metálica, primero se esteriliza pasándola por una llama. Una vez que el asa se enfría, se sumerge en un inóculo , como un cultivo microbiano o una muestra de paciente que contenga muchas especies o una gran cantidad de bacterias. ^{[ 5 ]} Se utilizan técnicas asépticas para mantener los cultivos microbiológicos y prevenir la contaminación del medio de cultivo . ^{[ 1 ]}

Los primeros ejemplos de siembra por estrías se movían en una sola dirección a lo largo de la placa, a diferencia de la técnica de "zigzag" de vaivén que se prefiere hoy en día. ^{[ 5 ]} Se han desarrollado muchos métodos diferentes para sembrar en una placa. La elección de una técnica es una cuestión de preferencia individual y también puede depender de la cantidad de microorganismos que contiene la muestra. ^{[ 6 ]}

El patrón más común utilizado es el de estrías en cuadrantes , también llamado "estrías de cuatro sectores" y "método de estrías de cuatro vías". ^{[ 6 ]} Este método consiste en dividir la placa de agar en cuatro secciones o cuadrantes. Para comenzar, un asa estéril se introduce en el primer cuadrante de la placa y se mueve de un lado a otro varias veces a lo largo de la superficie del agar, desde el exterior hacia el centro. Una vez completado cada cuadrante anterior, la placa se gira 90 grados y se debe utilizar un asa de inoculación recién esterilizada. ^{[ 5 ]} Comenzando desde la parte inferior del cuadrante anterior, el asa de inoculación se desliza suavemente sobre la mitad de las estrías del primer cuadrante antes de cubrir el siguiente. Este proceso se repite secuencialmente a través de los cuatro cuadrantes, de modo que el último contendrá la sección más diluida. ^{[ 1 ]}

El patrón de siembra en tres fases, también conocido como T-Streak, se recomienda para principiantes. ^{[ 6 ]} Sin embargo, también está limitado en aplicaciones que utilizan más de un cultivo. ^{[ 6 ]} La placa se divide dibujando una "T" para crear tres secciones separadas. Gire la placa de modo que la parte superior de la "T" esté más alejada de su mano dominante. ^{[ 7 ]} Comenzando desde esta primera sección, se arrastra un asa de inoculación esterilizada sobre la superficie del agar de un lado a otro en un movimiento en zigzag hasta que se haya cubierto aproximadamente un tercio de la placa. Luego, se vuelve a esterilizar el asa y se gira la placa 90 grados. Comenzando en la sección previamente sembrada, se arrastra el asa a través de ella dos o tres veces continuando el patrón en zigzag antes de pasar a cubrir una segunda sección. Luego, el procedimiento se repite una vez más, teniendo cuidado de no tocar los sectores previamente sembrados. ^{[ 6 ]} Cada vez, el asa recoge menos y menos bacterias hasta que recoge solo células bacterianas individuales que pueden crecer en una colonia. La placa debería mostrar el mayor crecimiento en la primera sección. La segunda sección tendrá menos crecimiento y algunas colonias aisladas, mientras que la sección final tendrá la menor cantidad de crecimiento y muchas colonias aisladas. ^{[ 7 ]}

Para su uso tanto en diluciones como en cultivos puros , la siembra por estrías radiantes comienza extendiendo una pequeña porción de agar en un lado de la placa con un asa estéril. Partiendo de la sección estriada en un lado, trace una serie de líneas verticales a lo largo de la placa, extendiéndose hacia el otro lado en forma de rayos. Luego, cambie a un nuevo asa de inoculación estéril y trace líneas horizontales que crucen las verticales a medida que desciende por la placa. ^{[ 6 ]}

La siembra continua es un método utilizado para distribuir uniformemente una muestra en una placa para su propagación o para aumentar el tamaño del cultivo. Se realiza comenzando desde el exterior y avanzando hacia el interior de la placa en un solo movimiento. Este método es rápido, pero solo es aplicable a muestras muy diluidas o cuando ya se ha obtenido una cepa pura. ^{[ 6 ]} En laboratorios que desean ahorrar material, una sola placa se puede dividir en secciones y utilizar la siembra continua para un material diferente en cada sección, lo que permite sembrar un número máximo de muestras a la vez. ^{[ 6 ]}

Otro método continuo es el estriado en zigzag , que también se utiliza para propagar muestras de cultivo. ^{[ 6 ]} Comenzando desde el lado más alejado de su mano dominante, mueva un asa esterilizada de un lado a otro de la placa. Utilice movimientos amplios a lo largo de todo el ancho de la placa para cubrir la mayor área de la superficie del agar . ^{[ 7 ]}

El objetivo principal de esta técnica es obtener una muestra pura aislando un solo tipo de microorganismo de una población mixta. Los profesionales utilizan el método de siembra por estrías para producir colonias individuales y distintas en una superficie de agar. Este proceso implica la dilución del inóculo bacteriano en el medio hasta que las células estén lo suficientemente separadas como para crecer en grupos aislados ^{[ 3 ] [ 1 ]} . Para lograr los mejores resultados, los clínicos suelen emplear el método de cuatro cuadrantes. Este método implica rotar la placa de Petri y esterilizar el asa entre secciones, reduciendo sistemáticamente la concentración de bacterias. Tan pronto como se selecciona y cultiva una sola colonia, el cultivo se considera un cultivo microbiológico puro, lo cual es un requisito fundamental para pruebas posteriores precisas ^{[ 3 ] [ 8 ]} . Integrar el seguimiento moderno en este proceso, como Previ Isola (un sistema automatizado estándar para la inoculación de muestras y el seguimiento de aislamientos previos), es crucial. La utilización de estos sistemas es beneficiosa porque estandariza el proceso de inoculación, reduciendo el error humano y asegurando que los fluidos corporales se procesen con alta reproducibilidad ^{[ 3 ]} . Aunque los métodos manuales son tradicionales, la investigación muestra que la siembra automatizada puede aumentar el rendimiento de colonias aisladas y mejorar la consistencia en comparación con los métodos de siembra manual ^{[ 3 ]} . Es importante recordar que el objetivo de esta precisión es identificar el microbio responsable de una infección, lo que permite un tratamiento antibiótico dirigido. Una desventaja de la siembra manual en placa es que requiere mucho tiempo para dominarla y ejecutarla. Sin embargo, al comparar el trabajo manual con los sistemas automatizados, aunque puede tomar la misma cantidad de tiempo para realizar la siembra en sí, la consistencia que proporciona la automatización a menudo conduce a menos repeticiones ^{[ 3 ]} . En el final, la siembra en placa sigue siendo el estándar ejemplar para separar mezclas complejas en componentes estudiables porque sin aislamiento no puede haber un diagnóstico definitivo ^{[ 1 ] [ 8 ]} .

La placa sobre la que se sembrará una muestra es una placa de Petri que contiene un medio de cultivo . Las bacterias necesitan diferentes nutrientes para crecer. ^{[ 9 ]} Esto incluye agua, una fuente de energía, fuentes de carbono, nitrógeno y minerales adicionales, factores de crecimiento y otras vitaminas específicas para el tipo de bacteria. ^{[ 10 ]} Un tipo de medio muy común utilizado en laboratorios de microbiología es el agar , una sustancia gelatinosa derivada de algas marinas. ^{[ 11 ]} El medio de agar nutritivo crea una sustancia estéril y transparente que puede soportar las altas temperaturas de la incubación bacteriana manteniendo su forma. ^{[ 12 ]} La elección del medio de cultivo depende del microorganismo que se esté cultivando o seleccionando. Los medios selectivos también se pueden utilizar para el aislamiento bacteriano. Al añadir un inhibidor, como un antibiótico, al medio de cultivo, se puede seleccionar para evitar que las cepas bacterianas no deseadas crezcan en la placa. ^{[ 10 ]}

Dependiendo de la cepa, la placa estriada puede luego incubarse , generalmente de 24 a 46 horas, para permitir que las bacterias se reproduzcan. ^{[ 13 ]} Algunas cepas de bacterias, por ejemplo, la especie Bartonella , requieren períodos de incubación más largos debido a tasas de crecimiento lentas. ^{[ 13 ]} Durante la incubación, las placas se mantienen a una temperatura constante dentro del laboratorio. Comúnmente, los cultivos se mantienen a temperaturas cercanas a los 25  °C, la temperatura ambiente estándar. ^{[ 14 ]} Sin embargo, algunos microorganismos requieren incubación a diferentes temperaturas específicas para su rango de altas tasas de crecimiento y supervivencia que deben tenerse en cuenta. ^{[ 14 ]} Al configurar la incubación, coloque la tapa sobre la placa de Petri y voltee la placa boca abajo, la porción con el agar estriado debe servir como la parte superior. Esto se hace para que cualquier condensación que se forme durante el proceso caiga sobre las bacterias que se están cultivando. ^{[ 15 ]} Al final de la incubación debe haber suficientes bacterias para formar colonias visibles en las áreas tocadas por el asa de inoculación. A partir de estas colonias mixtas, se pueden identificar especies bacterianas o fúngicas individuales basándose en sus diferencias morfológicas (tamaño/forma/color). ^{[ 16 ]} Posteriormente, se puede subcultivar en una nueva placa de cultivo para obtener un cultivo puro para su posterior análisis. ^{[ 5 ]}

El uso de placas de estrías para obtener cultivos puros de bacterias es una técnica empleada en diversos campos científicos como la patología , la taxonomía y la ecología . ^{[ 17 ]} Las bacterias en el medio ambiente suelen presentarse en poblaciones mixtas. Para poder estudiar las características infecciosas, morfológicas y fisiológicas de una especie, es necesario aislar las bacterias en cepas puras genéticamente idénticas. ^{[ 18 ]} La siembra en estrías se utiliza comúnmente en la investigación de enfermedades infecciosas . Las placas de estrías permiten analizar la respuesta a los antibióticos y realizar la secuenciación del genoma para analizar la composición genética individual de una cepa. También se utilizan en el proceso de transformación , la manipulación de rasgos en bacterias mediante la adición o eliminación de genes específicos. ^{[ 13 ]}

• césped bacteriano

^{[ 1 ]}

^{[ 2 ]} `1

• Método de siembra en placa de agar para obtener colonias aisladas (vídeo).