ADN polimerasa T7

Figura 2. Transferencia de nucleótidos por la ADN polimerasa.

La ADN polimerasa T7 cataliza la transferencia de fosforilo ^{[ 7 ]} durante la replicación del ADN del fago T7 . Como se muestra en la Figura 2 , el grupo hidroxilo 3' de un cebador actúa como nucleófilo y ataca el enlace fosfodiéster del nucleósido 5'-trifosfato (dTMP-PP). Esta reacción añade un nucleósido monofosfato al ADN y libera un pirofosfato (PPi). Generalmente, la reacción depende de metales y los cationes como el Mg²⁺ ^suelen estar presentes en el sitio activo de la enzima. ^{[ 7 ]}

Para la ADN polimerasa T7, los dedos, la palma y el pulgar ( Figura 1 ) posicionan el cebador-molde de manera que el extremo 3' de la cadena del cebador se posicione junto al sitio de unión del nucleótido (ubicado en la intersección de los dedos y el pulgar). ^{[ 8 ]} El par de bases formado entre el nucleótido y la base del molde encaja perfectamente en un surco entre los dedos y el extremo 3' del cebador. ^{[ 8 ]} Dos iones Mg²⁺ ^forman una red de coordinación octaédrica con el ligando de oxígeno y también acercan el hidroxilo reactivo del cebador y el α-fosfato del nucleótido, reduciendo así el costo entrópico de la adición nucleofílica . ^{[ 8 ]} El paso limitante de la velocidad en el ciclo catalítico ocurre después de que el nucleósido trifosfato se une y antes de que se incorpore al ADN (correspondiente al cierre del subdominio de los dedos alrededor del ADN y el nucleótido). ^{[ 8 ]}

Los aminoácidos presentes en el sitio activo contribuyen a crear un entorno estabilizador para que la reacción se lleve a cabo. Aminoácidos como Lys522 , Tyr526 , His506 y Arg518 actúan como donadores de enlaces de hidrógeno . El carbonilo del esqueleto de Ala476 , Asp475 y Asp654 forma enlaces de coordinación con los iones ^Mg²⁺ .

Asp475 y Asp654 forman un puente con los cationes Mg ²⁺ para orientarlos correctamente. El ion Mg ²⁺ de la derecha ( Figura 3 ) interactúa con los oxígenos cargados negativamente de los fosfatos alfa (α), beta (β) y gamma (γ) para alinear el enlace escindible para que el cebador ataque. ^{[ 8 ]} Incluso si no hay una base general dentro del sitio activo para desprotonar el hidroxilo del cebador, el pka disminuido del hidroxilo unido al metal favorece la formación del nucleófilo 3'-hidróxido. ^{[ 8 ]} Los iones metálicos y Lys522 contactan con oxígenos no puenteantes en el fosfato α para estabilizar la carga negativa que se desarrolla en el fósforo α durante la formación del enlace con el nucleófilo.

Además, la cadena lateral de Lys522 también se mueve para neutralizar el grupo pirofosfato con carga negativa. Las cadenas laterales de Tyr526, His506, Arg518 y el oxígeno del grupo carbonilo del esqueleto de Ala476 participan en la red de enlaces de hidrógeno y ayudan a alinear el sustrato para la transferencia de fosforilo. ^{[ 8 ]}

La polimerasa T7 por sí sola tiene una procesividad muy baja . Se disocia del cebador -molde después de incorporar aproximadamente 15 nucleótidos. Tras la infección del huésped, la polimerasa T7 se une a la tiorredoxina del huésped en una proporción 1:1. La interacción hidrofóbica entre la tiorredoxina y la polimerasa T7 ayuda a estabilizar la unión de la polimerasa T7 al cebador -molde. Además, la unión de la tiorredoxina aumenta la procesividad de la polimerasa T7 casi 80 veces. ^{[ 9 ]} El mecanismo preciso por el cual el complejo tiorredoxina-polimerasa T7 logra tal aumento en la procesividad aún se desconoce. La unión de la tiorredoxina expone una gran cantidad de residuos de aminoácidos básicos en la región del pulgar de la polimerasa T7. Varios estudios sugieren que la interacción electrostática entre estos residuos básicos con carga positiva y el esqueleto de fosfato con carga negativa del ADN y otras proteínas accesorias es responsable del aumento de la procesividad en el complejo gp5/tiorredoxina. ^{[ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]}

gp4 es una proteína hexamérica que contiene dos dominios funcionales: un dominio helicasa y un dominio primasa . El dominio helicasa desenrolla el ADN de doble cadena para proporcionar la plantilla para la replicación. La cola C-terminal del dominio helicasa contiene varios residuos ácidos con carga negativa que interactúan con el residuo básico expuesto de la polimerasa T7/tiorredoxina. Estas interacciones ayudan a cargar el complejo polimerasa T7/tiorredoxina en la horquilla de replicación . El dominio primasa cataliza la síntesis de oligorribonucleótidos cortos . Estos oligorribonucleótidos, llamados cebadores , son complementarios a la cadena molde y se utilizan para iniciar la replicación del ADN . En el sistema T7, el dominio primasa de una subunidad interactúa con el dominio primasa de la subunidad adyacente. Esta interacción entre los dominios primasa actúa como un freno para detener la helicasa cuando sea necesario, lo que asegura que la síntesis de la cadena líder se produzca al mismo ritmo que la síntesis de la cadena rezagada . ^{[ 11 ]}

gp2.5 tiene una función similar a la de la proteína de unión a ADN monocatenario . gp2.5 protege el ADN monocatenario producido durante la replicación y coordina la síntesis de las hebras conductora y rezagada mediante la interacción entre su cola C-terminal ácida y gp5/tiorredoxina. ^{[ 11 ]}

gp1.7 es una nucleósido monofosfato quinasa, que cataliza la conversión de desoxinucleósido 5'-monofosfatos en nucleótidos di y trifosfato, lo que explica la sensibilidad de la polimerasa T7 a los dideoxinucleótidos (véase Sequenase más adelante). ^{[ 11 ]}

La subunidad primaria gp5 de la ADN polimerasa T7, por sí sola, tiene baja procesividad y se disocia del ADN tras la incorporación de tan solo unos pocos nucleótidos. Para lograr una procesividad eficiente, la ADN polimerasa T7 recluta la tiorredoxina del huésped para formar un complejo tiorredoxina-gp5. La tiorredoxina se une al dominio de unión a tiorredoxina de gp5, estabilizando así una región de unión al ADN flexible de gp5. La estabilización de esta región de gp5 aumenta alostéricamente la interacción de la superficie proteica con la porción dúplex del cebador-molde. El complejo tiorredoxina-gp5 resultante incrementa la afinidad de la polimerasa T7 por el extremo del cebador aproximadamente 80 veces y actúa de forma procesiva tras unos 800 pasos de incorporación de nucleótidos. ^{[ 12 ]}

El mecanismo adoptado por la polimerasa T7 para lograr su procesividad difiere del de muchas otras polimerasas, ya que no depende de una pinza de ADN ni de un cargador de pinzas. En cambio, el complejo de la ADN polimerasa T7 requiere solo tres proteínas para la polimerización procesiva del ADN: la polimerasa T7 (gp5), la tiorredoxina de Escherichia coli y la proteína de unión a ADN monocatenario gp2.5. ^{[ 13 ]} Aunque estas tres proteínas son las únicas necesarias para la polimerización del ADN monocatenario molde, en un entorno biológico nativo la tiorredoxina-gp5 interactúa con la helicasa gp4, que proporciona el molde de ADN monocatenario (figura 4). Durante la síntesis de la cadena conductora, la tiorredoxina-gp5 y gp4 forman un complejo de alta afinidad que aumenta la procesividad general de la polimerasa a alrededor de 5 kb. ^{[ 14 ] [ 15 ]}

La ADN polimerasa T7 posee actividad exonucleasa de ADN de cadena simple y doble en dirección 3'-5' . Esta actividad se activa cuando una base recién sintetizada no se aparea correctamente con la cadena molde. La escisión de las bases incorporadas incorrectamente actúa como un mecanismo de corrección de errores, aumentando así la fidelidad de la polimerasa T7. ^{[ 4 ]} Durante la caracterización inicial de la actividad exonucleasa, se descubrió que la oxidación de la polimerasa T7 catalizada por hierro producía una enzima modificada con una actividad exonucleasa muy reducida. Este descubrimiento condujo al desarrollo y uso de la polimerasa T7 como secuenciadora en los primeros métodos de secuenciación de ADN. ^{[ 16 ]}

El mecanismo por el cual la ADN polimerasa T7 detecta la incorporación de una base no coincidente sigue siendo objeto de estudio. Sin embargo, algunos estudios han aportado evidencia que sugiere que los cambios en la tensión de la cadena de ADN molde, causados ​​por el desajuste de pares de bases, pueden inducir la activación de la exonucleasa. Wuite et al. observaron que la aplicación de una tensión superior a 40 pN al ADN molde resultó en un aumento de 100 veces en la actividad de la exonucleasa. ^{[ 17 ]}

La mutagénesis dirigida es un método de biología molecular que se utiliza para realizar cambios específicos e intencionados en la secuencia de ADN de un gen y sus productos . Esta técnica se desarrolló en una época en la que la ADN polimerasa comercial de mayor calidad para convertir un oligonucleótido en una cadena de ADN complementaria completa era el fragmento grande (Klenow) de la ADN polimerasa 1 de E. coli. Sin embargo, la ligación puede ser un problema en la mutagénesis con oligonucleótidos. Esto ocurre cuando la ADN ligasa funciona de forma ineficiente en relación con la ADN polimerasa, lo que puede provocar el desplazamiento de la cadena del oligonucleótido y, por lo tanto, reducir la frecuencia de mutación. Por otro lado, la ADN polimerasa T7 no realiza síntesis por desplazamiento de cadena y, por consiguiente, puede utilizarse para obtener altas frecuencias de mutación para mutantes puntuales, independientemente de la ligación. ^{[ 18 ]}

La clonación de ADNc es una tecnología fundamental para el análisis de la expresión genómica. La primera cadena completa se puede sintetizar mediante transcriptasas inversas disponibles comercialmente. La síntesis de la segunda cadena representó en su momento una limitación importante para la clonación de ADNc. Se desarrollaron dos grupos de métodos, que difieren en el mecanismo de iniciación, para sintetizar la segunda cadena. En un primer grupo, la iniciación de la síntesis de la segunda cadena tiene lugar dentro de la secuencia de la primera cadena. Sin embargo, se requiere la digestión del extremo 3' de la primera cadena, lo que conlleva la pérdida de las secuencias correspondientes al extremo 5' del ARNm. En un segundo grupo, la iniciación de la síntesis de la segunda cadena tiene lugar fuera de la secuencia de la primera cadena. Este grupo de métodos no requiere la digestión del extremo 3' de la primera cadena. Sin embargo, la limitación de este grupo de métodos radica en la elongación. La clonación con la ADN polimerasa T7 ayuda a superar esta limitación al permitir la digestión del tracto de poli(dT) durante la reacción de síntesis de la segunda cadena. Por lo tanto, no es necesario que el tamaño del segmento sintetizado con transferasa terminal se encuentre dentro de un rango de tamaño determinado, y los clones resultantes contienen un segmento de tamaño limitado. Además, debido a la alta actividad exonucleasa 3' de la ADN polimerasa T7, se puede obtener un alto rendimiento de la segunda cadena de longitud completa. ^{[ 19 ]}

En la secuenciación de Sanger , uno de los principales problemas relacionados con las ADN polimerasas es la discriminación contra los dideoxinucleótidos, los nucleótidos que terminan la cadena. La mayoría de las ADN polimerasas conocidas discriminan fuertemente contra los ddNTP; por lo tanto, se debe usar una alta proporción de ddNTP a dNTP para una terminación de cadena eficiente. La ADN polimerasa T7 discrimina contra los ddNTP solo unas pocas veces; por lo tanto, requiere una concentración mucho menor de ddNTP para proporcionar una alta uniformidad de las bandas de ADN en el gel. Sin embargo, su fuerte actividad exonucleasa 3'-5' puede interrumpir la secuenciación, ya que cuando la concentración de dNTP disminuye, la actividad exonucleasa aumenta, lo que resulta en una síntesis neta de ADN nula o degradación del ADN. Para su uso en la secuenciación de ADN, la ADN polimerasa T7 se ha modificado para eliminar su actividad exonucleasa, ya sea químicamente (Sequenase 1.0) o mediante la eliminación de residuos (Sequenase Versión 2.0). ^{[ 4 ] [ 20 ]}