Toxina B de Clostridioides difficile

El extremo C-terminal de TcdB (la región verde de la Fig. 2) contiene una región conocida como oligopéptidos repetitivos combinados (CROPs) que contiene los residuos de aminoácidos 1831–2366. ^{[ 9 ]} Estos CROPs forman 19–24 repeticiones cortas (SR) de aminoácidos, aproximadamente 31 repeticiones largas (LR) de aminoácidos, la toxina A y la toxina B. ^{[ 9 ] [ 10 ]} La región CROPs de TcdB consta de 19 SR y 4 LR. Esta región de SR y LR permite la formación de motivos de unión a la pared celular que ayudan a unirse a las fracciones de azúcar de las superficies celulares. ^{[ 9 ]}

Para purificar la toxina B de cultivos celulares de C. difficile , se utiliza el caldo de infusión cerebro-corazón porque promueve la síntesis de la toxina B. ^{[ 11 ]} El método de filtración facilita la purificación de la toxina B del sobrenadante de C. difficile . La concentración de toxina del sobrenadante es proporcional al recuento de células del organismo. Muchos estudios han propuesto que la mayoría de las toxinas se liberan en la fase logarítmica tardía o en las fases estacionarias tempranas , por lo que la toxina B es secretada continuamente por las células. ^{[ 2 ]} Aunque existen muchos métodos empleados por diferentes estudios para purificar la toxina B, la mayoría de los estudios utilizan métodos que implican concentraciones de sulfato de amonio ultrafiltrado o precipitación , en lugar de filtración en gel o cromatografía de intercambio iónico . Además, la eficacia del método de cromatografía de intercambio iónico ayuda a diferenciar entre TcdA y TcdB.

Diversos estudios han demostrado que la presencia de TcdB en células de mamíferos provoca cambios rápidos en la morfología y la señalización celular . En un corto período de tiempo, las células presentan placas con bajas concentraciones de TcdB y TcdA. Además, la muerte celular es una consecuencia importante de la intoxicación celular . Una investigación realizada por Donta et al. reveló que TcdB tiene graves efectos en otras células de mamíferos, como células de ovario de hámster chino , células epiteliales cervicales humanas , células suprarrenales de ratón, hepatocitos de rata y astrocitos de rata (Fig. 3). ^{[ 15 ] [ 16 ]}

La actividad citotóxica se basa en los tipos de células, que pueden variar de 4 a 200 veces. Generalmente, cuando las células se infectan con TcdB, no solo pierden su integridad estructural, sino también las disminuciones de los filamentos de actina F. [ ^{17 ] El} redondeamiento celular por TcdB no tarda más de 2 horas (Fig. 4), pero en lo que respecta a la muerte celular , puede tardar aproximadamente 24 horas. ^{[ 15 ]} Con respecto a la diarrea asociada a C. difficile (CDAD), los efectos de la citopatogenicidad son más críticos que la muerte celular real porque una vez que las células pierden la integridad del filamento de actina del citoesqueleto , también pierden su función normal.

La causa de la actividad citotóxica de TcdB dentro de la célula huésped está mediada principalmente por endocitosis de receptores . Los endosomas ácidos permiten que la toxina B entre en el citosol . Este fenómeno tiene lugar por una región de unión del receptor , que permite que la toxina entre en las células huésped . A través de la accesibilidad del citosol de las células huésped , TcdB desactiva las pequeñas GTPasas (Fig. 5), por ejemplo, los miembros de la familia Rho Rac y Cdc42 por el proceso de glicosilación de la treonina 35 en Cdc42 y Rac, y la treonina 37 en Rho. ^{[ 18 ] [ 19 ]} Estas GTPasas Rho se encuentran ubicuamente en el citosol de las células eucariotas que son responsables de la organización del citoesqueleto de actina porque las toxinas en el citosol causan condensación de filamentos de actina como consecuencia del redondeamiento celular y la formación de vesículas en la membrana (Fig. 3), lo que finalmente conduce a la apoptosis . ^{[ 20 ] [ 21 ]} La TcdB provoca cambios críticos en la dinámica y morfología celular . La figura 3 muestra el probable efecto de la toxina B en la superficie celular; formación de vesículas en la membrana (flechas negras). ^{[ 22 ]} Además, la TcdB inactiva las GTPasas Rho. Como consecuencia, se alteran las uniones célula-célula, lo que aumenta la permeabilidad epitelial a la toxina B y la acumulación de líquido en la luz. Este es uno de los principales agentes causantes de la diarrea asociada a C. difficile (CDAD) (Fig. 5). ^{[ 23 ] [ 24 ]}

Además, la tasa de hidrólisis de UDP-glucosa por TcdB es aproximadamente cinco veces mayor que la de TcdA. ^{[ 25 ]} Varios estudios han indicado que Rho presenta modificación postraduccional a través de prenilación y carboximetilación, que ocurre en el lado citoplasmático de la membrana plasmática , por lo tanto, el intercambio de GTP a GDP . ^{[ 26 ]} Cuando TcdB se une a Rho y otras GTPasas pequeñas , el GTP se hidroliza a GDP , lo que lleva a la unión de GTP (activo) a la unión de GDP (inactivo) (Fig. 5). Además, esta actividad de intercambio está regulada por factores de guanina en el citosol de la célula. ^{[ 27 ]}

TcdB accede al interior de la célula a través de la endocitosis mediada por clatrina , ^{[ 30 ]} Cuando la toxina B es parte del citosol , la glucosiltransferasa pasa a través de la membrana endosomal , lo que disminuye el pH, induce la translocación y finalmente conduce a cambios morfológicos de los residuos de la región de translocación (958–1130). ^{[ 31 ]} Las regiones hidrofóbicas están incrustadas en la membrana del huésped para formar poros que permiten el paso de los dominios de la glucosiltransferasa . ^{[ 31 ]} Cuando las células se infectan con TcdB en un ambiente ácido, se atenúan las toxinas y causa reordenamientos de la forma (Fig. 6). ^{[ 31 ]} Como consecuencia del pH ácido, TcdB muestra claras diferencias en la fluorescencia original del triptófano , la susceptibilidad a las proteasas y las superficies hidrofóbicas . ^{[ 31 ]} Otro grupo ha demostrado que la acidificación conduce a cambios conformacionales de la toxina y, más importante aún, ayuda a formar poros. ^{[ 7 ]} Una supuesta región de translocación (Fig. 2) comprende aproximadamente 801–1400 aminoácidos, de los cuales los residuos 958–1130 son hidrofóbicos y son responsables de la formación de poros transmembrana. ^{[ 20 ]} La mayoría de los estudios utilizaron la cepa TcdB 630 para mostrar la actividad de formación de poros de las toxinas de C. difficile . ^{[ 31 ]}

Para ver si los efectos de la escisión proteolítica de TcdB tienen lugar en la superficie celular o en endosomas ácidos , los estudios utilizaron Bafilomicina A1 , que se sabe que bloquea las H ⁺ -ATPasas de tipo v de los endosomas. Esto reduce la acidez en los endosomas. ^{[ 31 ]} La vía de captación fisiológica de TcdB previene la actividad citopática de TcdB. ^{[ 31 ]} Cuando las células estuvieron en condiciones ácidas (pH 4.0) durante 5 minutos después de la unión de TcdB a la superficie celular a 37 grados Celsius, se observaron reordenamientos de forma y redondeamiento. Sin embargo, cuando las células redondeadas se incubaron durante una hora adicional en pH neutro (7.0) con parámetros similares, no se observó redondeamiento celular. ^{[ 15 ] [ 31 ]} Ambos estudios mostraron que la toxina B tiene una propiedad de escisión proteolítica , que es crítica para el acceso al citosol . ^{[ 7 ] [ 15 ] [ 31 ]} Tener un pH ácido en el endosoma conduce a alteraciones topológicas de TcdB (Figura 6). ^{[ 7 ]}

El gen que codifica la proteína TcdB, tcdB , se encuentra dentro de la región cromosómica de 19,6 kb . Esta se conoce como el locus de patogenicidad o PaLoc (Figura 2). ^{[ 32 ] [ 33 ]} El marco de lectura abierto (ORF) para tcdB tiene una longitud de 7098 nucleótidos . ^{[ 17 ]} Es importante mencionar que, además de los principales genes de toxinas en la región PaLoc, hay otros tres genes accesorios que codifican en la región PaLoc: tcdR (L), tcdC (R) y tcdE en el medio. Estos genes ayudan a regular la expresión de TcdA y TcdB. También ayudan a secretar o liberar las toxinas de la célula. ^{[ 17 ]} El gen codificante tcdE , ubicado entre tcdB y tcdA, es análogo a las proteínas holinas ; por lo tanto, se sugiere que tcdE funciona como un gen facilitador que mejora la liberación o secreción de TcdA y TcdB, aumentando así la permeabilidad de la membrana de la célula huésped . ^{[ 17 ]}

Existen diferentes tamaños de plásmidos de C. difficile . Los pesos moleculares detectados varían de 2,7 × 10 ⁶ a 100 × 10 ⁶ , pero los tamaños de plásmidos no muestran correlación con la toxicidad . Para detectar el nivel de toxina B en C. difficile , los médicos utilizan ampliamente ensayos de cultivo celular derivados de muestras de heces de pacientes con PMC . ^{[ 2 ] [ 3 ]} El ensayo de cultivo celular se considera un "estándar de oro" para detectar la toxicidad en C. difficile porque una pequeña cantidad de toxina B es capaz de causar redondeamiento celular (Fig. 4), por lo tanto, es una gran ventaja para los laboratorios clínicos hacer correlaciones con CDAD causado por TcdB. ^{[ 2 ] [ 3 ]} Aunque se encontró actividad citotóxica de toxinas clostridiales grandes (LCT) en muestras de heces de pacientes con PMC, la actividad de la toxina B tuvo efectos citotóxicos más perjudiciales en comparación con la toxina A. ^{[ 2 ]} Por lo tanto, la actividad de la toxina A se atenúa cuando no se aísla de la toxina B. ^{[ 2 ] [ 3 ]} La detección de la toxicidad de C. difficile es extremadamente sensible, sin embargo, el uso del ensayo de cultivo celular permite a los laboratorios clínicos superar el desafío; el uso de dosis tan pequeñas como 1 pg/mL de toxina B es suficiente para causar redondeamiento celular. ^{[ 2 ] [ 3 ]} Esta es la principal ventaja de utilizar el ensayo de tejido de cultivo para detectar toxicidad en pacientes con PMC . ^{[ 2 ]} Aunque los laboratorios clínicos han intentado utilizar un ensayo inmunoenzimático en placa de microtitulación (ELISA) y otras técnicas para detectar la actividad citotóxica de la toxina B en las heces de pacientes con PMC , los resultados no son tan precisos como los obtenidos con ensayos de cultivo celular . ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 34 ]}

Al agregar antimicrobianos , por ejemplo clindamicina , al medio de cultivo, los estudios han demostrado que la actividad citotóxica en cultivos de C. difficile aumenta de 4 a 8 veces. ^{[ 35 ] [ 36 ]} Además, conociendo el papel de los antibióticos en las causas de PMC, muchos estudios anteriores se centraron en los efectos de los antimicrobianos en la producción de toxinas. Como resultado, los estudios pudieron concluir que la naturaleza subinhibitoria de los niveles de vancomicina y penicilina aumentaba la producción de toxinas en cultivos de C. difficile . ^{[ 37 ]} Las cantidades de producción de toxinas se correlacionaron con el uso del medio de cultivo para los organismos. Otro estudio ilustró que los altos niveles de producción de toxinas de TcdB se observaron en medios complejos como el caldo de infusión de cerebro y corazón . ^{[ 38 ] [ 39 ]} Se produjeron altos niveles de toxinas con el aislamiento de altamente virulento . Por el contrario, se produjeron bajos niveles de toxinas con el aislamiento de débilmente virulento . Por lo tanto, muestra que las producciones de toxinas estaban correguladas. Aunque el mecanismo detrás de la participación del ambiente en la modulación de las señales que expresan las toxinas no se entiende, los estudios in vitro han demostrado que la expresión de la toxina se fortalece por la represión catabólica y el estrés, por ejemplo, antibióticos . ^{[ 40 ] [ 41 ] [ 42 ]} Otro estudio ha demostrado que limitar la biotina en un medio bien caracterizado aumenta la producción de TcdB en 64 veces y TcdA en 35 veces. Esto se hizo con C. difficile y dosis de biotina tan pequeñas como 0,05 nM. ^{[ 41 ]} Varios otros estudios tempranos han argumentado en contra de la teoría de que la producción de toxina tenga algo que ver con el estrés o la represión catabólica de la toxina TcdA o TcdB. ^{[ 42 ]} Además, muchos estudios dicen que la razón principal de las diferencias entre otros estudios se debe a que la producción de toxina no ocurre con todos los aislados de C. difficile .

Bezlotoxumab es un anticuerpo monoclonal humano diseñado para la prevención de la recurrencia de infecciones por Clostridium difficile. Mediante la cristalización por rayos X de la estructura del extremo N-terminal de TcdB, se identificó que la toxina consta de tres dominios: un dominio de glucosiltransferasa (GTD), una proteasa de cisteína y un dominio de oligopéptido repetitivo combinado (CROP). Bezlotoxumab se une específicamente a dos sitios homólogos dentro del dominio CROP de TcdB. El análisis estructural mediante cristalografía de rayos X indica que la unión del anticuerpo ocluye parcialmente los posibles sitios de unión a carbohidratos. En consonancia con esta idea, Bezlotoxumab bloquea la unión de TcdB a las células de mamíferos. ^{[ 45 ]}

En las primeras etapas de la enfermedad de PMC , muchos estudios han especulado que TcdA es más potente que TcdB. Esto se ha deducido de experimentos in vivo donde la producción de toxinas de TcdA fue más grave que la de TcdB con cetitis por antibióticos. ^{[ 38 ] [ 46 ]} Posteriormente, varios estudios mostraron que TcdB juega un papel importante en la enfermedad de PMC y ADD. El estudio demostró que incluso cuando C. difficile no produjo TcdA, aún mostró síntomas de la enfermedad. ^{[ 47 ]} Además, estudios posteriores han demostrado que una forma purificada de TcdB es una enterotoxina más letal en comparación con TcdA, y también, que el epitelio intestinal está gravemente dañado y causa una respuesta inflamatoria aguda. ^{[ 48 ]} Con una mejor comprensión de la toxina, los investigadores pudieron afirmar que TcdB es el principal factor de virulencia que causa CDI por encima de TcdA. Sin embargo, cuando TcdA está presente en el intestino, ayuda a facilitar la actividad de TcdB para que tenga impactos más amplios, afectando así a múltiples sistemas orgánicos. ^{[ 49 ]} Además, cuando se vacunó a hámsteres contra TcdA, se demostró que no estaban completamente protegidos contra la enfermedad por C. difficile , lo que llevó a estudios a concluir que TcdB es muy letal y potente. ^{[ 50 ]} Asimismo, la inyección intravenosa o intraperitoneal de una pequeña dosis de TcdA junto con una dosis letal de TcdB resultó suficiente para causar la muerte de un animal. Por lo tanto, TcdA actúa como facilitador de la salida de TcdB del intestino. ^{[ 50 ]}