movimiento de partículas atadas

Para que el movimiento esté dominado por el polímero y no por la esfera, se debe observar que el número de excursión, N _R , ^{[ 2 ]} será menor que 1:

${\displaystyle N_{R}\equiv {\frac {r}{\sqrt {L\cdot {l_{p}/3}}}}<1}$

dónde${\displaystyle r}$es el radio de la cuenta,${\displaystyle L}$es la longitud de contorno del polímero y${\displaystyle l_{p}}$es la longitud de persistencia (50  nm en condiciones fisiológicas) del polímero. (También es posible trabajar cuando${\displaystyle N_{R}>1}$pero debe tratarse con cuidado.)

Las microesferas metálicas (generalmente de oro) dispersan la luz con alta intensidad, por lo que se pueden usar microesferas muy pequeñas (de aproximadamente 40  nm de diámetro) y aun así obtener una buena imagen. Por otro lado, las microesferas metálicas no son la herramienta adecuada para experimentos con pinzas ópticas .

Las microesferas de poliestireno dispersan la luz más débilmente que los metales (para obtener la misma intensidad que se obtiene con  una microesfera de oro de 40 nm, ¡la microesfera de poliestireno debería ser de ~125  nm! ^{[ 3 ]} ), pero tiene la ventaja de que se puede combinar con experimentos de pinzas ópticas.

La principal ventaja de las fluorescencias es que la longitud de onda de excitación y la de emisión no coinciden, por lo que se puede utilizar un filtro dicroico para obtener una señal más nítida. La desventaja de las fluorescencias es el fotoblanqueo .

Todos los tipos y diámetros de microesferas (con el marcador bioquímico, consulte la sección de montaje del conector) son fabricados por empresas comerciales y se pueden adquirir fácilmente.

Se puede fabricar un chip con dos cubreobjetos. Uno de ellos debe perforarse para crear dos orificios que permitan inyectar los reactivos en la celda de flujo. Los portaobjetos deben limpiarse para eliminar la suciedad. Un baño ultrasónico es una buena herramienta para ello; 15 minutos en isopropanol deberían ser suficientes. A continuación, se debe crear un canal. Una forma de hacerlo es cortar parafilm por la mitad, dejando un marco de parafilm que servirá como espaciador entre los portaobjetos. Los portaobjetos deben ensamblarse uno encima del otro con el parafilm cortado entre ellos. El último paso es calentar el chip para que el parafilm se derrita y pegue los portaobjetos entre sí.

Primero, el chip debe ser pasivado para que el polímero no se adhiera al vidrio, hay muchos reactivos bloqueantes disponibles (BSA, alfa-caseína, etc.) y se debe encontrar el que mejor funcione para la situación específica. Luego, la superficie debe ser recubierta con un anticuerpo u otra molécula reactiva (como anti- digoxigenina ) que se unirá a un antígeno ( digoxigenina ) en un extremo del polímero. Después de una incubación de aproximadamente 45 min, el exceso de anticuerpo debe lavarse. Después de lavar el exceso de anticuerpo, el polímero debe inyectarse en el chip e incubarse durante aproximadamente el mismo tiempo. El polímero había sido modificado previamente en los extremos. Un extremo tiene una cola de biotina y el otro tiene una cola de digoxigenina. Después de la incubación, el polímero no unido debe lavarse de la celda. Luego, las perlas recubiertas con anti- biotina deben inyectarse en la celda de flujo e incubarse durante aproximadamente 30-45 min. Las perlas sobrantes deben lavarse.

Como se mencionó anteriormente, la imagen no muestra la cuenta en sí, sino un punto más grande según su PSF ( función de dispersión de punto ). Además, el tamaño del píxel en la cámara puede reducir la resolución de la medición. Para extraer la posición exacta de la cuenta (que corresponde al vector de extremo a extremo), se debe encontrar el centro del punto con la mayor precisión posible. Esto se puede hacer con buena resolución utilizando dos técnicas diferentes, ambas basadas en las características del punto. La intensidad de la luz en el plano focal se distribuye como un disco de Airy y tiene simetría circular.

Una función gaussiana bidimensional es una buena aproximación para el disco de Airy . Ajustando esta función al punto se pueden encontrar los parámetros.${\displaystyle x_{0}}$y${\displaystyle y_{0}}$que son las coordenadas del centro del punto y del vector de extremo a extremo.

La segunda técnica consiste en encontrar el centro de intensidad, ^{[ 4 ]} utilizando la definición de centro de masa :

${\displaystyle {\vec {R}}_{cm}={\frac {1}{I_{tot}}}\cdot \sum _{k=1}^{N}I_{k}\cdot {\vec {r}}_{k}}$

dónde${\displaystyle {\vec {R}}_{cm}}$es la coordenada del centro de masa,${\displaystyle \textstyle I_ {tot}}$es la intensidad total del punto, y${\displaystyle \textstyle I_ {k}}$y${\displaystyle \textstyle {\vec {r}}_{k}}$son la intensidad y la coordenada del k -ésimo píxel. Debido a la simetría circular, la coordenada del centro de intensidad es la coordenada del centro de la esfera. Ambas técnicas nos proporcionan la coordenada del vector de extremo a extremo con una resolución superior al tamaño del píxel.

Normalmente, todo el sistema sufre una deriva durante la medición. Existen varios métodos para corregir esta deriva, que generalmente se pueden dividir en 3 grupos:

La frecuencia del movimiento browniano es mucho mayor que la frecuencia de deriva, por lo que se puede utilizar un filtro de paso alto para eliminar la deriva. Se puede lograr un efecto similar suavizando los datos y restando la señal suavizada de los datos originales (véase la figura).

Si se muestran pocas cuentas en el fotograma, debido a que cada cuenta se mueve aleatoriamente, promediar su posición en cada fotograma debería darnos la deriva (debería restarse de los datos para obtener datos limpios).

Si se muestra una cuenta inmovilizada en el marco, podemos tomar su posición como referencia y corregir los datos en función de ella. (Otra ventaja de observar la cuenta inmovilizada es que su movimiento nos indica la precisión de la medición). Por supuesto, se puede utilizar más de un método.

Es común ajustar estadísticas de caminata aleatoria al vector de extremo a extremo del polímero. ^{[ 5 ]} Para 1 dimensión obtendremos la distribución normal , y para 2 dimensiones la distribución de Rayleigh :

${\displaystyle P_{1D}(x)dx={\sqrt {\frac {3}{4{\pi }Ll_{p}}}}\exp {\left(-{\frac {3x^{2}}{4Ll_{p}}}\right)}dx\,\,\,;\,\,\,\,\,\,P_{2D}(R)dR=2{\pi }R{\frac {3}{4{\pi }Ll_{p}}}\exp {\left(-{\frac {3R^{2}}{4Ll_{p}}}\right)}dR}$

dónde${\displaystyle L}$es la longitud del contorno y${\displaystyle l_{p}}$es la longitud de persistencia. Tras recopilar los datos de la serie temporal, se debe ajustar el histograma de los datos a la función de distribución (unidimensional o bidimensional). Si se conoce la longitud de contorno del polímero, el único parámetro de ajuste es la longitud de persistencia.

Debido a la fuerza entrópica , el polímero actúa como un resorte de Hooke. Según la distribución de Boltzmann , la distribución es proporcional al exponente de la relación entre la energía elástica y la energía térmica :

${\displaystyle P(x)\propto \exp {\left(-{\frac {{\frac {1}{2}}kx^{2}}{K_{B}T}}\right)}}$

dónde ${\displaystyle k}$es la constante elástica ,${\displaystyle K_{B}}$es la constante de Boltzmann y${\displaystyle T}$es la temperatura. Tomando el logaritmo de la distribución${\displaystyle P(x)}$y ajustándolo a una forma de parábola , se puede obtener la constante elástica del polímero: ^{[ 6 ]}

${\displaystyle \displaystyle k=2{\alpha }K_{B}T}$

dónde${\displaystyle \alpha }$es el coeficiente de${\displaystyle x^{2}}$del ajuste de la parábola.