Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

Experimento con una sola molécula

Moléculas de polímero individuales (cadenas de 0,4 nm de espesor) registradas en medios acuosos a diferentes pH utilizando un AFM . Se observa un cambio drástico en la conformac...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita
Moléculas de polímero individuales (cadenas de 0,4 nm de espesor) registradas en medios acuosos a diferentes pH utilizando un AFM . Se observa un cambio drástico en la conformación de la cadena polimérica ante una pequeña variación del pH. [ 1 ]

Un experimento de molécula única es aquel que investiga las propiedades de moléculas individuales . Los estudios de molécula única se diferencian de las mediciones en un conjunto o colección de moléculas, donde no se puede distinguir el comportamiento individual de las moléculas y solo se pueden medir características promedio . Dado que muchas técnicas de medición en biología, química y física no son lo suficientemente sensibles para observar moléculas individuales, las técnicas de fluorescencia de molécula única (que surgieron desde la década de 1990 para investigar diversos procesos a nivel de moléculas individuales) causaron gran entusiasmo, ya que proporcionaron muchos detalles nuevos sobre los procesos medidos que antes no eran accesibles. De hecho, desde la década de 1990 se han desarrollado muchas técnicas para investigar moléculas individuales. [ 2 ]

Los primeros experimentos de molécula única fueron experimentos de patch clamp realizados en la década de 1970, pero estos se limitaron al estudio de canales iónicos . Hoy en día, los sistemas investigados mediante técnicas de molécula única incluyen el movimiento de la miosina sobre filamentos de actina en el tejido muscular y los detalles espectroscópicos de entornos locales individuales en sólidos. Las conformaciones de polímeros biológicos se han medido mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). Mediante espectroscopía de fuerza , se pueden estirar mecánicamente moléculas individuales (o pares de moléculas que interactúan), generalmente polímeros , y registrar su respuesta elástica en tiempo real.

Historia

En la fase gaseosa a presiones ultrabajas, los experimentos con moléculas individuales se han realizado durante décadas, pero en la fase condensada solo desde 1989 con el trabajo de WE Moerner y Lothar Kador. [ 3 ] Un año después, Michel Orrit y Jacky Bernard también pudieron demostrar la detección de la absorción de moléculas individuales por su fluorescencia. [ 4 ]

Muchas técnicas permiten observar moléculas individuales, sobre todo la espectrometría de masas , donde se detectan iones aislados. Además, uno de los primeros métodos para detectar moléculas individuales surgió en el campo de los canales iónicos con el desarrollo de la técnica de patch clamp por Erwin Neher y Bert Sakmann (quienes posteriormente ganaron el Premio Nobel por sus contribuciones fundamentales). Sin embargo, la idea de medir la conductancia para observar moléculas individuales supuso una limitación importante en el tipo de sistemas que podían estudiarse.

La fluorescencia es un método práctico para observar moléculas individuales, principalmente gracias a la sensibilidad de los detectores ópticos comerciales, capaces de contar fotones individuales. Sin embargo, desde el punto de vista espectroscópico, la observación de una molécula requiere que esta se encuentre en un entorno aislado y que emita fotones al ser excitada. Gracias a la tecnología de detección de fotones individuales mediante tubos fotomultiplicadores (PMT) o fotodiodos de avalancha (APD), es posible registrar eventos de emisión de fotones con gran sensibilidad y resolución temporal.

Más recientemente, la fluorescencia de molécula única ha despertado un gran interés en la obtención de imágenes biológicas, mediante el marcaje de biomoléculas como proteínas y nucleótidos para estudiar la función enzimática, que no puede estudiarse fácilmente a gran escala debido a los sutiles movimientos dependientes del tiempo en la catálisis y la reorganización estructural. La proteína más estudiada ha sido la clase de enzimas miosina/actina presentes en los tejidos musculares. Mediante técnicas de molécula única, se ha observado y caracterizado el mecanismo de pasos en muchas de estas proteínas.

En 1997, Katrin Kneipp , H. Kneipp, Y. Wang, LT Perelman y otros [ 5 ] demostraron la detección de moléculas individuales mediante espectroscopia Raman mejorada en superficie (SERS) en el MIT , y de forma independiente S. Nie y SR Emory en la Universidad de Indiana . [ 6 ] El equipo del MIT utilizó excitación Raman no resonante y mejora de superficie con nanocúmulos de plata para detectar moléculas individuales de violeta de cresilo , mientras que el equipo de la Universidad de Indiana utilizó excitación Raman resonante y mejora de superficie con nanopartículas de plata para detectar moléculas individuales de rodamina 6G .

Los nanomanipuladores, como el microscopio de fuerza atómica, también son adecuados para experimentos de molécula única de importancia biológica, ya que operan en la misma escala de longitud que la mayoría de los polímeros biológicos. Además, la microscopía de fuerza atómica (AFM) es apropiada para el estudio de moléculas de polímeros sintéticos. La AFM ofrece una posibilidad única de visualización 3D de cadenas de polímeros. Por ejemplo, el modo de contacto intermitente de la AFM es lo suficientemente suave para registrar moléculas de polielectrolitos adsorbidas (por ejemplo,  cadenas de poli(2-vinilpiridina) de 0,4 nm de espesor) en un medio líquido. La ubicación de la superposición de dos cadenas corresponde en estos experimentos al doble del espesor de una sola cadena (0,8  nm en el caso del ejemplo mencionado). Al aplicar los parámetros de escaneo adecuados, la conformación de dichas moléculas permanece inalterada durante horas, lo que permite realizar experimentos en medios líquidos con diversas propiedades. [ 1 ] Además, al controlar la fuerza entre la punta y la muestra, se pueden obtener imágenes de alta resolución. [ 7 ] [ 8 ] Las pinzas ópticas también se han utilizado para estudiar y cuantificar las interacciones ADN-proteína. [ 7 ] [ 8 ]

Acerca de los experimentos

Concepto

La espectroscopia de fluorescencia de molécula única utiliza la fluorescencia de una molécula para obtener información sobre su entorno, estructura y posición. Esta técnica permite obtener información que de otro modo no estaría disponible debido al promedio de conjunto (es decir, una señal obtenida al registrar muchas moléculas al mismo tiempo representa una propiedad promedio de la dinámica de las moléculas). Los resultados en muchos experimentos con moléculas individuales son trayectorias de dos estados .

Grabación monocanal

Dos ejemplos de datos (de aproximadamente 10 s cada uno) de un experimento de registro de canal único mediante la técnica de patch clamp. El trazo superior corresponde a una concentración menor, mientras que el inferior se registró a una concentración de agonista cercana a la EC50 de este canal iónico . Las aperturas del canal se representan mediante deflexiones hacia abajo, en este caso de aproximadamente 5 pA.

Como en el caso de la espectroscopia de fluorescencia de molécula única, la técnica conocida como registro de canal único puede utilizarse para obtener información cinética específica —en este caso sobre la función del canal iónico— que no está disponible cuando se realiza un registro de conjunto, como el registro de célula completa. [ 9 ] Específicamente, los canales iónicos alternan entre clases conductoras y no conductoras, que difieren en conformación. Por lo tanto, el estado funcional de los canales iónicos puede medirse directamente con electrónica suficientemente sensible, siempre que se tomen las precauciones adecuadas para minimizar el ruido. A su vez, cada una de estas clases puede dividirse en uno o más estados cinéticos con relación directa con la función subyacente del canal iónico. Realizar este tipo de estudios de molécula única bajo condiciones que varían sistemáticamente (por ejemplo, concentración y estructura del agonista, ion permeante y/o bloqueador del canal, mutaciones en los aminoácidos del canal iónico), puede proporcionar información sobre la interconversión de varios estados cinéticos del canal iónico. [ 10 ] En un modelo mínimo para un canal iónico, hay dos estados : abierto y cerrado. Sin embargo, a menudo se necesitan otros estados para representar con precisión los datos, incluidos múltiples estados cerrados, así como estados inactivos y/o desensibilizados, que son estados no conductores que pueden ocurrir incluso en presencia de un estímulo. [ 9 ]

Marcaje de biomoléculas

Los fluoróforos individuales pueden unirse químicamente a biomoléculas, como proteínas o ADN, y la dinámica de las moléculas individuales puede rastrearse mediante el monitoreo de la sonda fluorescente. Se pueden rastrear los movimientos espaciales dentro del límite de Rayleigh , junto con los cambios en la intensidad de emisión y/o el tiempo de vida radiativo, que a menudo indican cambios en el entorno local. Por ejemplo, el marcaje de moléculas individuales ha proporcionado una gran cantidad de información sobre cómo las proteínas motoras kinesina se mueven a lo largo de los filamentos de microtúbulos en las células musculares. La obtención de imágenes de moléculas individuales en células vivas revela información interesante sobre la dinámica de las proteínas en su entorno fisiológico. Se pueden cuantificar varios parámetros biofísicos sobre la dinámica de las proteínas, como el coeficiente de difusión, los desplazamientos cuadráticos medios, el tiempo de residencia, la fracción de moléculas unidas y no unidas, y el mecanismo de búsqueda del objetivo de la unión de la proteína a su sitio objetivo en la célula viva. [ 11 ]

Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de molécula única (FRET)

Artículo principal smFRET .

En la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de molécula única , la molécula se marca en al menos dos puntos. Un haz láser se enfoca sobre la molécula, excitando la primera sonda. Cuando esta sonda se relaja y emite un fotón, tiene la posibilidad de excitar la otra sonda. La eficiencia de la absorción del fotón emitido por la primera sonda en la segunda depende de la distancia entre ellas. Dado que la distancia varía con el tiempo, este experimento permite estudiar la dinámica interna de la molécula.

En comparación con los experimentos de conjunto

Al observar datos relacionados con moléculas individuales, generalmente se pueden construir propagadores y funciones de densidad de probabilidad de tiempo de salto, de primer orden, de segundo orden, etc., mientras que a partir de experimentos a granel, generalmente se obtiene el decaimiento de una función de correlación. [ 12 ] A partir de la información contenida en estas funciones únicas (obtenidas de moléculas individuales), se puede extraer una imagen relativamente clara de cómo se comporta el sistema; por ejemplo, su esquema cinético , o su potencial de actividad, o su forma de dimensiones reducidas . [ 13 ] [ 14 ] En particular, se puede construir (muchas propiedades de) la ruta de reacción de una enzima al monitorear la actividad de una enzima individual. [ 15 ] Además, varios autores han descrito aspectos significativos con respecto al análisis de datos de moléculas individuales, como métodos de ajuste y pruebas para poblaciones homogéneas. [ 9 ] Por otro lado, existen varios problemas con el análisis de datos de moléculas individuales, incluyendo la construcción de un entorno de bajo ruido y puntas de pipeta aisladas, el filtrado de algunos de los componentes no deseados restantes (ruido) que se encuentran en las grabaciones y el tiempo requerido para el análisis de datos (preprocesamiento, detección inequívoca de eventos, representación gráfica de datos, ajuste de esquemas cinéticos, etc.).

Impacto

Las técnicas de molécula única han impactado la óptica, la electrónica, la biología y la química. En las ciencias biológicas, el estudio de las proteínas y otros mecanismos biológicos complejos se limitaba a experimentos de conjunto que prácticamente imposibilitaban la observación directa de su cinética. Por ejemplo, solo después de utilizar la microscopía de fluorescencia de molécula única para estudiar pares de kinesina-miosina en el tejido muscular se comprendió la observación directa de los mecanismos de locomoción. Sin embargo, estos experimentos se han limitado en su mayoría a estudios in vitro, ya que aún no se han desarrollado por completo las técnicas útiles para la obtención de imágenes de células vivas. La promesa de la obtención de imágenes in vivo de molécula única [ 16 ] , sin embargo, conlleva un enorme potencial para observar directamente biomoléculas en procesos naturales. Estas técnicas se suelen utilizar para estudios que involucran proteínas de baja copia, muchas de las cuales aún se están descubriendo. Estas técnicas también se han extendido al estudio de áreas de la química, incluyendo el mapeo de superficies heterogéneas [ 17 ] .

Véase también

Referencias

  1. 1 2 Roiter V, Minko S (2005). "Experimentos de AFM de molécula única en la interfaz sólido-líquido: conformación in situ de cadenas de polielectrolitos flexibles adsorbidas". Journal of the American Chemical Society . 127 (45): 15688– 15689. doi : 10.1021/ja0558239 . PMID 16277495 . 
  2. ↑ Juette MF, Terry DS, Wasserman MR, Zhou Z, Altman RB, Zheng Q, Blanchard SC (junio de 2014). " El brillante futuro de la imagen de fluorescencia de molécula única" . Curr Opin Chem Biol . 20 : 103–111 . doi : 10.1016/j.cbpa.2014.05.010 . PMC 4123530. PMID 24956235 .  
  3. ↑ WE Moerner y L. Kador, Detección óptica y espectroscopia de moléculas individuales en un sólido , Phys. Rev. Lett. 62, 2535 - 2538 (1989)
  4. ↑ M. Orrit y J. Bernard, Moléculas individuales de pentaceno detectadas mediante excitación de fluorescencia en un cristal de p -terfenilo , Phys. Rev. Lett. 65, 2716–2719 (1990)
  5. ↑ Kneipp, Katrin ; Wang, Yang; Kneipp, Harald; Perelman, Lev T.; Itzkan, Irving; Dasari, Ramachandra R.; Feld, Michael S. (1997-03-03). "Detección de moléculas individuales mediante dispersión Raman intensificada en superficie (SERS)" . Physical Review Letters . 78 (9): 1667– 1670. doi : 10.1103/PhysRevLett.78.1667 . ISSN 0031-9007 . 
  6. ↑ Nie, Shuming; Emory, Steven R. (1997-02-21). "Sondeo de moléculas individuales y nanopartículas individuales mediante dispersión Raman intensificada en superficie" . Science . 275 (5303): 1102– 1106. doi : 10.1126/science.275.5303.1102 . ISSN 0036-8075 . 
  7. 1 2 Murugesapillai D, et al. (2014). "El puenteo y el bucle del ADN por HMO1 proporcionan un mecanismo para estabilizar la cromatina libre de nucleosomas" . Nucleic Acids Res . 42 (14): 8996– 9004. doi : 10.1093 / nar/gku635 . PMC 4132745. PMID 25063301 .   
  8. 1 2 Murugesapillai D, et al. (2016). "Estudios de molécula única de proteínas de flexión de ADN arquitectónicas del grupo B de alta movilidad" . Biophys Rev. 9 ( 1): 17– 40. doi : 10.1007/s12551-016-0236-4 . PMC 5331113. PMID 28303166 .   
  9. ^ B. Sakmann y E. Neher, Grabación monocanal , ISBN . 9780306414190(1995).
  10. ↑ Picones, A; Keung, E; Timpe, LC (2001). "Variación de la conductancia unitaria en Kir2.1 y en los canales de potasio rectificadores internos cardíacos" . Biophys J. 81 ( 4): 2035–2049 . doi : 10.1016/S0006-3495(01)75853-5 . PMC 1301677 . 
  11. ↑ Podh, Nitesh Kumar; Paliwal, Sheetal; Dey, Partha; Das, Ayan; Morjaria, Shruti; Mehta, Gunjan (5 de noviembre de 2021). "Imágenes de moléculas individuales in vivo en levaduras: aplicaciones y desafíos". Journal of Molecular Biology . 433 (22) 167250. doi : 10.1016/j.jmb.2021.167250 . PMID 34537238. S2CID 237573437 .  
  12. ↑ O. Flomenbom, J. Klafter y A. Szabo, ¿Qué se puede aprender de las trayectorias de moléculas individuales de dos estados? Archivado el 14 de enero de 2012 en Wayback Machine , Biophys. J. 88, 3780–3783 (2005) ; arXiv : q-bio/0502006
  13. ↑ O. Flomenbom y RJ Silbey, Utilización del contenido informativo en trayectorias de dos estados. Archivado el 14 de enero de 2012 en Wayback Machine , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 10907–10910 (2006) .
  14. ↑ O. Flomenbom y RJ Silbey, Toolbox for analyse finite two-state trajectories, Phys. Rev. E 78, 066105 (2008) ; arXiv:0802.1520 .
  15. ↑ O. Flomenbom, K. Velonia, D. Loos, et al., Decaimiento exponencial extendido y correlaciones en la actividad catalítica de moléculas individuales de lipasa fluctuantes Archivado el 14 de enero de 2012 en Wayback Machine , Proc. Natl. Acad. Sci. US 102, 2368–2372 (2005) .
  16. ↑ Zhan, Hong; Stanciauskas, Ramunas; Stigloher, Christian; Keomanee-Dizon, Kevin; Jospin, Maelle; Bessereau, Jean-Louis; Pinaud, Fabien (2014). "La imagen de molécula única in vivo identifica dinámicas alteradas de los canales de calcio en C. elegans mutante de distrofina" . Nature Communications . 5 ncomms5974. Bibcode : 2014NatCo...5.4974Z . doi : 10.1038/ncomms5974 . PMC 4199201. PMID 25232639 .  
  17. ↑ Walder, R.; Nelson, N.; Schwartz, DK (2011). "Mapeo de superficies de superresolución utilizando las trayectorias de sondas moleculares" . Nature Communications . 2 : 515. Bibcode : 2011NatCo...2..515W . doi : 10.1038/ncomms1530 . PMID 22044994 .