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Modulación génica terapéutica

La modulación génica terapéutica se refiere a la práctica de alterar la expresión de un gen en alguna de sus etapas, con el fin de aliviar alguna dolencia. Se diferencia de la t...

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La modulación génica terapéutica se refiere a la práctica de alterar la expresión de un gen en alguna de sus etapas, con el fin de aliviar alguna dolencia. Se diferencia de la terapia génica en que la modulación génica busca alterar la expresión de un gen endógeno (quizás mediante la introducción de un gen que codifica una nueva proteína moduladora), mientras que la terapia génica se centra en la introducción de un gen cuyo producto beneficia directamente al receptor.

La modulación de la expresión génica puede producirse a nivel de transcripción mediante agentes de unión al ADN (que pueden ser factores de transcripción artificiales ), moléculas pequeñas u oligonucleótidos sintéticos . También puede producirse a nivel postranscripcional mediante interferencia de ARN .

Modulación génica transcripcional

Un enfoque de modulación terapéutica utiliza agentes que modulan la transcripción endógena, dirigiéndose específicamente a esos genes a nivel del ADN genómico (ADNg) . La ventaja de este enfoque sobre la modulación a nivel del ARNm o de las proteínas radica en que cada célula contiene una sola copia de ADNg. Por lo tanto, el número de copias diana es significativamente menor, lo que permite, en teoría, administrar los fármacos en dosis mucho más bajas.

Este enfoque también ofrece varias ventajas sobre la terapia génica tradicional . La focalización directa de la transcripción endógena debería producir una expresión relativa correcta de las variantes de empalme . En contraste, la terapia génica tradicional generalmente introduce un gen que puede expresar solo un transcrito, en lugar de un conjunto de variantes de transcripción empalmadas expresadas estequiométricamente. Además, los genes introducidos viralmente pueden ser dirigidos para el silenciamiento génico por metilación, lo que puede contrarrestar el efecto de la terapia génica tradicional. [ 1 ] No se prevé que esto sea un problema para la modulación transcripcional, ya que actúa sobre el ADN endógeno.

Existen tres categorías principales de agentes que actúan como moduladores transcripcionales de genes: oligonucleótidos formadores de triple hélice (TFO), poliamidas sintéticas (SPA) y proteínas de unión al ADN . [ 2 ]

Oligonucleótidos formadores de triple hélice

¿Qué son?

Los oligonucleótidos formadores de triple hélice (TFO) son un método potencial para lograr la modulación génica terapéutica. Los TFO tienen aproximadamente entre 10 y 40 pares de bases de longitud y pueden unirse al surco mayor del ADN bicatenario, lo que crea una tercera hebra o una triple hélice. [ 2 ] [ 3 ] La unión se produce en regiones de polipurinas o polipirimidinas mediante enlaces de hidrógeno de Hoogsteen a las bases de purina (A/G) del ADN bicatenario que ya se encuentra en forma de hélice de Watson-Crick . [ 4 ]

Cómo funcionan

Los TFO pueden ser moléculas de polipurina o polipirimidina y se unen a una de las dos hebras de la doble hélice en orientación paralela o antiparalela a las regiones diana de polipurina o polipirimidina. Dado que los códigos de reconocimiento de ADN son diferentes para la unión paralela y antiparalela de los TFO, los TFO compuestos de pirimidinas (C/T) se unen a la hebra rica en purinas de la doble hélice diana mediante enlaces de hidrógeno de Hoogsteen en paralelo. [ 3 ] Los TFO compuestos de purinas (A/G), o una mezcla de purina y pirimidina, se unen a la misma hebra rica en purinas mediante enlaces de Hoogsteen inversos en antiparalelo. Los TFO pueden reconocer hebras diana ricas en purinas para el ADN bicatenario. [ 2 ]

ADN de triple cadena: Los TFO se unen de forma similar al ADN de doble cadena, adoptando una configuración de triple hélice .

Complicaciones y limitaciones

Para que los motivos TFO se unan de forma paralela y creen enlaces de hidrógeno , el átomo de nitrógeno en la posición 3 del residuo de citosina debe estar protonado , pero a niveles de pH fisiológicos no lo está, lo que podría impedir la unión paralela. [ 2 ]

Otra limitación es que los TFO solo pueden unirse a cadenas diana ricas en purinas, lo que limitaría la elección de sitios diana de genes endógenos a secuencias de polipurinas y polipirimidinas en el ADN bicatenario. Si se generara un método que permitiera a los TFO unirse también a bases pirimídicas, esto les permitiría dirigirse a cualquier parte del genoma . Además, el genoma humano es rico en secuencias de polipurinas y polipirimidinas, lo que podría afectar la especificidad de los TFO para unirse a una región diana del ADN. Un enfoque para superar esta limitación es desarrollar TFO con nucleótidos modificados que actúen como ácidos nucleicos bloqueados para aumentar la afinidad de los TFO por secuencias diana específicas. [ 5 ]

Otras limitaciones incluyen preocupaciones sobre la afinidad y especificidad de unión, la estabilidad in vivo y la captación celular. Los investigadores están intentando superar estas limitaciones mejorando las características de TFO mediante modificaciones químicas , como la modificación de la estructura principal de TFO para reducir las repulsiones electrostáticas entre TFO y el dúplex de ADN. Además, debido a su alto peso molecular, la captación celular es limitada, y algunas estrategias para superar esto incluyen agentes condensantes de ADN , el acoplamiento de TFO a residuos hidrofóbicos como el colesterol o agentes de permeabilización celular. [ 2 ]

¿Qué pueden hacer?

Los científicos siguen perfeccionando la tecnología para convertir los TFO en un producto terapéutico , y gran parte de esto gira en torno a sus posibles aplicaciones en la terapia antigénica. En particular, se han utilizado como inductores de mutaciones sitio-específicas , reactivos que escinden selectiva y específicamente el ADN diana, y como moduladores de la expresión génica . [ 6 ] Un método de modificación de la secuencia genética consiste en dirigir el ADN con TFO para activar un gen diana . Si una secuencia diana se encuentra entre dos copias inactivas de un gen, los ligandos de ADN, como los TFO, pueden unirse al sitio diana y serían reconocidos como lesiones del ADN. Para reparar estas lesiones, se ensamblan complejos de reparación de ADN en la secuencia diana, y el ADN se repara. El daño del sustrato de recombinación intramolecular puede repararse y detectarse si la resección llega lo suficientemente lejos como para producir extremos compatibles a ambos lados del sitio de escisión y luego los extremos 3' se ligan, lo que lleva a la formación de una única copia activa del gen y la pérdida de todas las secuencias entre las dos copias del gen. [ 4 ]

En sistemas modelo, los TFO pueden inhibir la expresión génica a nivel del ADN, así como inducir mutagénesis dirigida en el modelo. [ 6 ] La inhibición de la elongación de la transcripción inducida por TFO en objetivos endógenos se ha probado con éxito en cultivos celulares. [ 7 ] Sin embargo, a pesar del gran éxito in vitro , se han logrado avances limitados en aplicaciones celulares, posiblemente debido a la accesibilidad del objetivo.

Los TFO tienen el potencial de silenciar genes diana al dirigirse a la iniciación o elongación de la transcripción, detenerse en los sitios de unión del triplete o introducir cambios permanentes en una secuencia diana mediante la estimulación de las vías de reparación intrínsecas de la célula. Estas aplicaciones pueden ser relevantes para el desarrollo de terapias contra el cáncer que inhiban la expresión génica a nivel del ADN. Dado que la expresión génica aberrante es una característica distintiva del cáncer, modular los niveles de expresión de estos genes endógenos podría constituir una terapia para diversos tipos de cáncer .

poliamidas sintéticas

Las poliamidas sintéticas son un conjunto de moléculas pequeñas que forman enlaces de hidrógeno específicos con el surco menor del ADN. Pueden ejercer su efecto de forma directa, uniéndose a una región reguladora o transcrita de un gen para modificar la transcripción, o indirecta, mediante conjugación con otro agente que produce alteraciones alrededor del sitio diana del ADN.

Representación esquemática del reconocimiento de una secuencia de ADN por una poliamida sintética. La secuencia de ADN 5'-GTAC-3' es reconocida por los pares de aminoácidos Py/Im, Py/Hp, Hp/Py e Im/Py. Véase [ 8 ] [ 9 ] para la estructura química.

Estructura

Las bases específicas en el surco menor del ADN pueden ser reconocidas y unidas por pequeñas poliamidas sintéticas (SPA). Las SPA que se unen al ADN se han diseñado para contener tres componentes de aminoácidos poliamida: hidroxipirrol (Hp), imidazol (Im) y pirrol (Py). [ 10 ] Las cadenas de estos aminoácidos se pliegan sobre sí mismas en una estructura de horquilla. Los aminoácidos a cada lado de la horquilla forman un par que puede reconocer específicamente ambos lados de un par de bases de Watson-Crick . Esto ocurre a través de enlaces de hidrógeno dentro del surco menor del ADN. Los pares amida Py/Im, Py/Hp, Hp/Py e Im/Py reconocen los pares de bases de Watson-Crick CG, AT, TA y GC, respectivamente (Tabla 1). Véase la figura para una representación gráfica del reconocimiento de 5'-GTAC-3' por una SPA. Las SPA tienen baja toxicidad, pero aún no se han utilizado en la modulación genética humana.

Limitaciones y soluciones alternativas

El principal inconveniente estructural de los SPA no modificados como moduladores genéticos es que su secuencia de reconocimiento no puede extenderse más allá de 5 pares de bases de Watson-Crick. La curvatura natural del surco menor del ADN es un giro demasiado cerrado para que la estructura de horquilla coincida. Hay varios grupos con propuestas de soluciones alternativas a este problema. [ 8 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] Los SPA pueden hacerse para seguir mejor la curvatura del surco menor insertando beta-alanina, lo que relaja la estructura. [ 10 ] Otro enfoque para extender la longitud de reconocimiento es usar varias horquillas cortas en sucesión. [ 15 ] [ 16 ] Este enfoque ha aumentado la longitud de reconocimiento hasta once pares de bases de Watson-Crick.

Bloqueo de la transcripción de ARN mediante poliamida sintética por unión dentro de la región transcrita.
Bloqueo de factores de transcripción mediante poliamida sintética

Modulación directa

Las SPA pueden inhibir la transcripción mediante su unión a una región transcrita de un gen diana. Esta inhibición se produce al bloquear la elongación por parte de una ARN polimerasa.

Los SPA también pueden modular la transcripción al dirigirse a un sitio de unión de un regulador de la transcripción. Si el regulador es un activador de la transcripción, esto disminuirá los niveles de transcripción. Por ejemplo, se ha demostrado que la acción de un SPA dirigido al sitio de unión del factor de transcripción activador TFIIIA inhibe la transcripción del ARN 5S corriente abajo. [ 17 ] Por el contrario, si el regulador es un represor, esto aumentará los niveles de transcripción. Por ejemplo, la acción de un SPA dirigido al factor del huésped LSF, que reprime la expresión de la repetición terminal larga (LTR) del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) tipo 1, bloquea la unión de LSF y, en consecuencia, desreprime la expresión de LTR [ 18 ] .

Poliamida sintética conjugada con un agente modificador

Modulación conjugada

No se ha demostrado que los SPA modifiquen directamente el ADN ni que tengan actividad más allá del bloqueo directo de otros factores o procesos. Sin embargo, los agentes modificadores pueden unirse a los extremos de la estructura en horquilla. La unión específica del SPA al ADN permite dirigir el agente modificador conjugado a un sitio específico.

Los SPA se han combinado con los grupos alquilantes de ADN ciclopropilpirroloindol [ 19 ] y clorambucilo [ 20 ] , capaces de dañar y reticular el ADN del SV40. Este efecto inhibió el ciclo celular y el crecimiento. El clorambucilo, un agente quimioterapéutico, resultó más eficaz cuando se conjugó con un SPA que cuando no lo hizo.

En 2012, los SPA se conjugaron con SAHA, un potente inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC). [ 21 ] Los SPA con SAHA conjugado se dirigieron a Oct-3/4 y Nanog, lo que indujo una remodelación epigenética y, en consecuencia, aumentó la expresión de múltiples genes relacionados con la pluripotencia en fibroblastos embrionarios de ratón.

Proteínas de dedos de zinc diseñadas

Qué son/estructura

Las proteínas de dedos de zinc de diseño son proteínas modificadas genéticamente que se utilizan para dirigirse a áreas específicas del ADN . Estas proteínas aprovechan la capacidad de unión al ADN de los dominios de dedos de zinc naturales para modular áreas específicas del genoma . [ 22 ] Tanto en los motivos de dedos de zinc de diseño como en los naturales, la proteína consta de dos láminas β y una hélice α . Dos residuos de histidina en la hélice α y dos residuos de cisteína en las láminas β están unidos a un átomo de zinc , lo que sirve para estabilizar el dominio proteico en su conjunto. Esta estabilización beneficia particularmente a la hélice α en su función como dominio de reconocimiento y unión al ADN. El factor de transcripción TFIIIA es un ejemplo de una proteína natural con motivos de dedos de zinc. [ 23 ]

Ejemplo de motivos de dedos de zinc

Cómo funcionan

Los motivos de dedos de zinc se unen al surco mayor del ADN helicoidal, [ 23 ] donde la secuencia de residuos de aminoácidos en la hélice α le confiere al motivo su especificidad de secuencia diana. El dominio se une a una secuencia de ADN de siete nucleótidos (posiciones 1 a 6 en la cadena primaria del ADN, más las posiciones 0 y 3 en la cadena complementaria ), asegurando así que el motivo proteico sea altamente selectivo para su diana. [ 22 ] Para diseñar una proteína de dedos de zinc, los investigadores pueden utilizar técnicas como la mutagénesis dirigida seguida de ensayos aleatorios para la capacidad de unión, [ 22 ] [ 24 ] o la recombinación in vitro de motivos con especificidad de diana conocida para producir una biblioteca de proteínas finales específicas de secuencia. [ 25 ]

Dedos de zinc que se unen a una hélice de ADN
Mecanismos epigenéticos

Efectos e impactos en la modulación genética

Las proteínas de dedos de zinc diseñadas pueden modular la expresión del genoma de diversas maneras. En última instancia, dos factores son los principales responsables del resultado en la expresión: si la secuencia objetivo es una región reguladora o una región codificante del ADN, y si se unen al dominio de dedo de zinc dominios efectores , y de qué tipo. Si la secuencia objetivo de una proteína de diseño es un dominio regulador (por ejemplo, un promotor o un represor de la replicación ), el sitio de unión para los factores de transcripción naturales quedará oculto, lo que provocará una disminución o un aumento correspondiente, respectivamente, en la transcripción del gen asociado . [ 26 ] De manera similar, si la secuencia objetivo es un exón , el dedo de zinc diseñado ocultará la secuencia a los complejos de transcripción de la ARN polimerasa , lo que dará como resultado un producto génico truncado o no funcional. [ 22 ]

Los dominios efectores unidos al dedo de zinc también pueden tener efectos comparables. La función de estos dominios efectores es, sin duda, la más importante en lo que respecta al uso de proteínas de dedo de zinc diseñadas para la modulación génica terapéutica. Si un dominio metilasa se une a la proteína de dedo de zinc diseñada, cuando esta se une a la secuencia de ADN diana, se producirá un aumento en el estado de metilación del ADN en esa región. Como consecuencia, se reducirán las tasas de transcripción de los genes afectados. [ 27 ] Muchos de los dominios efectores funcionan para modular el ADN directamente, por ejemplo, mediante metilación, escisión, [ 28 ] o recombinación de la secuencia de ADN objetivo [ 29 ] , o modulando su tasa de transcripción, por ejemplo, inhibiendo la transcripción mediante dominios represores que bloquean la maquinaria transcripcional, [ 30 ] promoviendo la transcripción con dominios de activación que reclutan la maquinaria transcripcional al sitio, [ 31 ] o dominios de modificación de histonas u otros dominios de modificación epigenética que afectan el estado de la cromatina y la capacidad de la maquinaria transcripcional para acceder a los genes afectados. [ 32 ] La modificación epigenética es un tema importante en la determinación de los diferentes niveles de expresión de los genes, como se explica por la idea de que cuán fuertemente enrollada está la cadena de ADN, desde las histonas a nivel local hasta la cromatina a nivel cromosómico , puede influir en la accesibilidad de las secuencias de ADN a la maquinaria de transcripción, influyendo así en la tasa a la que se puede transcribir. [ 23 ] Si, en lugar de impactar directamente la cadena de ADN, como se describió anteriormente, una proteína de dedo de zinc diseñada afecta el estado de modificación epigenética de una región de ADN objetivo, se podría lograr una modulación de la expresión génica similar.

En el primer caso que demostró con éxito el uso de proteínas de dedos de zinc diseñadas para modular la expresión génica in vivo , Choo et al. [ 26 ] diseñaron una proteína compuesta por tres dominios de dedos de zinc que se dirigían a una secuencia específica en un oncogén de fusión BCR-ABL . Este oncogén específico está implicado en la leucemia linfoblástica aguda . El oncogén permite típicamente que las células leucémicas proliferen en ausencia de factores de crecimiento específicos, una característica distintiva del cáncer . Al incluir una señal de localización nuclear con la proteína de dedos de zinc de tres dominios para facilitar la unión de la proteína al ADN genómico en el núcleo, Choo et al. pudieron demostrar que su proteína modificada podía bloquear la transcripción del oncogén in vivo. Las células leucémicas se volvieron dependientes de factores de crecimiento normales, lo que permitió que el ciclo celular volviera a estar bajo el control de la regulación normal . [ 26 ]

Modulación genética postranscripcional

El principal método para la modulación génica postranscripcional es la interferencia de ARN (ARNi). El principal problema del uso de ARNi en la modulación génica es la administración del fármaco a las células diana. [ 33 ] [ 34 ] La modulación génica por ARNi se ha aplicado con éxito en ratones para el tratamiento de un modelo murino de enfermedad inflamatoria intestinal. [ 35 ] Este tratamiento utilizó nanopartículas estabilizadas basadas en liposomas dirigidas a la integrina beta-7 que encapsulaban ARN de interferencia cortos (siRNA). Existen otras formas de administración de ARNi, como la administración de poliplexos, los conjugados ligando-siRNA, la administración sin recubrimiento, la administración de partículas inorgánicas mediante nanopartículas de oro y la administración local específica del sitio. [ 36 ]

Importancia clínica

Por otro lado, las proteínas de dedos de zinc diseñadas han sido sometidas a algunos ensayos clínicos . La eficacia y seguridad de EW-A-401, un factor de transcripción de dedos de zinc modificado genéticamente, como agente farmacológico para el tratamiento de la claudicación , una afección cardiovascular , se ha investigado en ensayos clínicos. [ 37 ] La proteína consiste en un ADN plasmídico modificado que induce al paciente a producir un factor de transcripción modificado genéticamente, cuyo objetivo es el gen del factor de crecimiento endotelial vascular A (VEGF-A) , que influye positivamente en el desarrollo de los vasos sanguíneos . Aunque aún no ha sido aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA), se han completado dos estudios clínicos de fase I que identifican esta proteína de dedos de zinc como un agente terapéutico potencial prometedor y seguro para el tratamiento de la enfermedad arterial periférica en humanos. [ 38 ]

Véase también

Referencias

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