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expresión transitoria

La expresión transitoria , más frecuentemente denominada " expresión génica transitoria ", es la expresión temporal de genes que se expresan durante un breve período después de ...

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La expresión transitoria , más frecuentemente denominada " expresión génica transitoria ", es la expresión temporal de genes que se expresan durante un breve período después de que un ácido nucleico , generalmente ADN plasmídico que codifica un casete de expresión , se haya introducido en células eucariotas mediante un agente de transferencia química como el fosfato de calcio (CaPi) o la polietilenimina (PEI). [ 1 ] Sin embargo, a diferencia de la "expresión estable", el ADN extraño no se fusiona con el ADN de la célula huésped, lo que resulta en la inevitable pérdida del vector después de varios ciclos de replicación celular. [ 2 ] La mayoría de las expresiones génicas transitorias se realizan con células animales cultivadas. La técnica también se utiliza en células vegetales; sin embargo, la transferencia de ácidos nucleicos a estas células requiere métodos diferentes a los utilizados con células animales. Tanto en plantas como en animales, la expresión transitoria debería resultar en un uso limitado en el tiempo de los ácidos nucleicos transferidos, ya que cualquier expresión a largo plazo se denominaría "expresión estable".

La metodología varía según el organismo que se vaya a transformar . Si bien las plantas pueden transformarse con una construcción introducida en Agrobacterium tumefaciens mediante agroinfiltración o inmersión floral, la mayoría de las células animales requieren un vector viral . En humanos, el campo de la transformación transitoria avanzó rápidamente durante la pandemia de COVID-19 de 2020-2021 , con importantes vacunas contra la COVID-19 que utilizan la transferencia directa de ARNm a humanos o vectores adenovirales , donde el ARN se expresa en el huésped humano para producir proteínas de espícula que inducen una respuesta inmunitaria.

Ventajas

Al elegir entre inducir expresión transitoria o estable en células, se deben considerar el plazo y el objetivo experimental. Las células transfectadas transitoriamente se utilizan a menudo para estudiar los efectos de la expresión génica a corto plazo, realizar el silenciamiento génico mediado por interferencia de ARN (ARNi) o generar rápidamente proteínas recombinantes a pequeña escala. [ 3 ] Esta rápida generación de pequeñas cantidades de proteínas recombinantes puede aplicarse para evaluar su potencial como candidatos a fármacos o examinar la integridad de sus construcciones durante las etapas de desarrollo del vector. Además, la expresión transitoria puede ser una herramienta útil para optimizar parámetros seleccionados antes de someterse al proceso, que consume mucho tiempo, de ampliación de escala en células transfectadas de forma estable. [ 4 ] Normalmente, las células se recolectan entre 1 y 4 días después de una transfección exitosa . Para obtener resultados aún más rápidos, reemplazar el ADN con ARNm puede dar lugar a una expresión transitoria en cuestión de minutos después de una transfección exitosa en algunos sistemas; este proceso evita la translocación al núcleo y la transcripción . [ 5 ]

Si se desea una expresión génica estable y a largo plazo, la transfección estable de células resulta más útil. Sin embargo, dado que la integración exitosa de un vector de ADN en el cromosoma es poco frecuente, este proceso es más difícil y requiere más tiempo, por lo que se reserva para la producción de proteínas a gran escala, las terapias génicas y los estudios farmacológicos a largo plazo.

Expresión en células vegetales

Transformación genética mediada por Agrobacterium

(a) Representa el proceso de desactivación del plásmido inductor de tumores de Agrobacteria y su fusión con secuencias reguladoras virales de plantas. (b) Representa la coexpresión mediante la infiltración de varios cultivos de Agrobacteria que contienen vectores binarios separados o cultivos que poseen vectores únicos que contienen múltiples casetes de expresión.

La tecnología dominante utilizada para la producción de plantas transgénicas para expresión transitoria es la transformación genética mediada por Agrobacterium , o "agroinfiltración", y la maquinaria de expresión viral. [ 6 ] Agrobacterium tumefaciens y especies relacionadas de Agrobacterium son patógenos vegetales bien conocidos que han sido modificados genéticamente para transferir eficientemente fragmentos específicos de ADN (llamados ADN de transferencia o T-ADN) al núcleo de la planta mediante sistemas de vectores binarios , que consisten en un vector binario de T-ADN y un plásmido auxiliar vir . [ 7 ] Este vector binario separa el T-ADN de las proteínas de virulencia transactivas que ayudan a mediar la transferencia. [ 8 ] Las ventajas de este método incluyen la modularidad de plásmidos de pequeño tamaño y amplio rango de hospedadores mediante técnicas estándar de biología molecular. Además, dado que el plásmido parental inductor de tumores en las cepas de Agrobacterium ha sido desactivado y solo se han modificado células no reproductivas (a diferencia de las modificaciones de la línea germinal), el proceso se considera inocuo para el medio ambiente. [ 6 ]

Las aplicaciones de este proceso han propiciado avances en el uso de plantas en la biología sintética . Los bioproductos derivados de plantas prometen ser altamente competitivos frente a los sistemas tradicionales de expresión en células de mamíferos.

Expresión en células de mamíferos

Los sistemas de expresión en células de mamíferos son esenciales para la producción transitoria de proteínas recombinantes y sus modificaciones postraduccionales complementarias. De hecho, aproximadamente la mitad de las proteínas terapéuticas disponibles comercialmente se producen en células de mamíferos. Sin embargo, el lento crecimiento de los sistemas de células de mamíferos, sus precisos requisitos de crecimiento y el riesgo potencial de infección por virus animales presentan una serie de desafíos. Como resultado, se ha establecido un número creciente de líneas celulares de mamíferos para servir como huéspedes para la producción transitoria de proteínas recombinantes. [ 2 ]

células HEK293

Aunque otras líneas celulares, como la de riñón de mono verde africano (COS) y la de riñón de hámster bebé (BHK), pueden utilizarse para la producción de proteínas recombinantes, el sistema huésped más comúnmente empleado en la expresión transitoria de células de mamíferos implica derivados de la línea celular HEK293 , que se basa en la línea celular de riñón embrionario humano establecida en 1977 por Graham et al. [ 9 ] La línea celular HEK293 se creó mediante transformación con ADN de adenovirus 5 fragmentado. [ 10 ] Las ventajas de utilizar esta línea celular incluyen sus altas tasas de transfección y su capacidad para crecer en un medio libre de suero, lo que resulta en un costo reducido y un menor riesgo de contaminación con material de origen animal que se encuentra típicamente en el suero. [ 2 ]

Posteriormente se desarrollaron varias sublíneas modificadas genéticamente mediante la incorporación de elementos virales derivados de virus de mamíferos, como el virus SV40 o el virus de Epstein-Barr (VEB), que se caracterizan por su alta retención de ADN plasmídico en estado episomal y su capacidad para aumentar la transcripción y la traducción a través de propiedades virales específicas. [ 11 ] En consecuencia, se identificó que estas sublíneas posteriores tenían dos componentes que interactuaban: el antígeno T grande del SV40 que se une al origen de replicación del SV20 (SV40 ori ) y la proteína del antígeno nuclear-1 derivado del VEB ( EBNA-1 ) a su origen de replicación asociado ( oriP). [ 11 ]

Los rendimientos históricos típicos de expresión transitoria en células HEK293 transfectadas con PEI-25kDa fueron de 20-40 mg/L de proteína de anticuerpo recombinante. En 2008, Backliwal et al. informaron por primera vez rendimientos superiores a 1 g/L de proteína de anticuerpo recombinante. [ 12 ]

células CHO

Tradicionalmente, las células de ovario de hámster chino (CHO) se asocian con el establecimiento de líneas celulares estables para productos biológicos. Sin embargo, recientemente, los intentos de modificar genéticamente las células CHO para la producción transitoria de proteínas han ganado reconocimiento. Las células CHO fueron una de las primeras líneas celulares establecidas para el cultivo in vitro, y su potencial como huésped para la producción y fabricación de productos biológicos sigue siendo popular. [ 11 ] Las células CHO son preferibles para la expresión transitoria debido a su fácil escalado industrial, versatilidad para la producción de diversas biomoléculas y bajo riesgo de infección por virus humanos, entre otras ventajas. [ 13 ] Se han establecido tres sistemas de expresión principales:

  1. Línea celular CHO modificada genéticamente con EBNA-1
  2. Línea celular CHO EBNA LT, que contiene aparte el gen EBNA-1 y el antígeno T grande del poliomavirus de ratón [ 14 ].
  3. El sistema Epi CHO consiste en una línea celular CHO transfectada con el gen del antígeno T grande del poliomavirus y un vector de expresión de ADN que codifica el origen del poliomavirus ( PyOri ) para la replicación autónoma y EBNA-1 y OriP del EBV para la retención del plásmido. [ 15 ] [ 16 ]

Referencias

  1. ↑ Hacker DL (1 de enero de 2011). "2.29 - Tecnología recombinante". En Moo-Young M, Wurm FM (eds.). Biotecnología integral (Segunda  edición). Burlington: Academic Press. pp. 401–406 . doi : 10.1016/b978-0-08-088504-9.00120-3 . ISBN  978-0-08-088504-9.
  2. 1 2 3 Glick BR, Patten CL (enero de 2017). Biotecnología molecular: principios y aplicaciones del ADN recombinante (quinta ed.). doi : 10.1128/9781555819378 . ISBN  9781555819378.
  3. ↑ Strohl WR, Strohl LM (2013). Ingeniería de anticuerpos terapéuticos : avances actuales y futuros que impulsan el área de mayor crecimiento en la industria farmacéutica . Cambridge, Reino Unido: Woodhead Publishing. ISBN  978-1-907568-37-4OCLC 870891982​​ 
  4. ↑ Menassa R, Ahmad A, Joensuu JJ (21 de septiembre de 2011). «Expresión transitoria mediante agroinfiltración y sus aplicaciones en agricultura molecular». Agricultura molecular en plantas: avances recientes y perspectivas futuras . Dordrecht: Springer Netherlands. pp. 183–198 . doi : 10.1007/978-94-007-2217-0_9 . ISBN  978-94-007-2216-3.
  5. ↑ Strohl WR, Strohl LM (2012). «Clases de anticuerpos terapéuticos». Ingeniería de anticuerpos terapéuticos: avances actuales y futuros que impulsan el área de mayor crecimiento en la industria farmacéutica (1.ª ed.). Sawston: Woodhead Publishing. págs. 197–223 . doi : 10.1533/9781908818096.197 . ISBN   9781907568374.{{cite book}}: CS1 mantenimiento: ubicación del editor ( enlace )
  6. 1 2 Sainsbury F, Lomonossoff GP (junio de 2014). "Expresiones transitorias de biología sintética en plantas" . Current Opinion in Plant Biology . SI: Fisiología y metabolismo. 19 (100): 1– 7. Bibcode : 2014COPB...18D...5B . doi : 10.1016 / j.pbi.2014.02.003 . PMC 4070481. PMID 24631883 .  
  7. ↑ Bevan M (noviembre de 1984). "Vectores binarios de Agrobacterium para la transformación de plantas" . Nucleic Acids Research . 12 (22): 8711– 8721. doi : 10.1093/nar/12.22.8711 . PMC 320409. PMID 6095209 .  
  8. ↑ "Corrección a 'Un sistema de expresión génica transitoria mediado por Agrobacterium para hojas intactas' [ Plant Sci. 122 (1997) 101–108 ] " . Plant Science . 124 (2): 227. Mayo de 1997. Bibcode : 1997PlnSc.124..227. . doi : 10.1016/s0168-9452(97)04651-7 . ISSN 0168-9452 . 
  9. ↑ Voynov V, Caravella JA (2012). Proteínas terapéuticas : métodos y protocolos (2.ª ed.). Nueva York: Humana Press. ISBN   978-1-61779-921-1OCLC 798095845​​ 
  10. ↑ Graham FL, Smiley J, Russell WC, Nairn R (julio de 1977). "Características de una línea celular humana transformada por ADN del adenovirus humano tipo 5" . The Journal of General Virology . 36 (1): 59–74 . doi : 10.1099/0022-1317-36-1-59 . PMID 886304 . 
  11. 1 2 3 Geisse S, Voedisch B (2012). "Tecnologías de expresión transitoria: pasado, presente y futuro". Proteínas terapéuticas . Métodos en biología molecular. Vol. 899. Totowa, NJ: Humana Press. págs. 203–219 . doi : 10.1007/978-1-61779-921-1_13 . ISBN   978-1-61779-920-4. PMID 22735955 . 
  12. ↑ Backliwal G, Hildinger M, Chenuet S, Wulhfard S, De Jesus M, Wurm FM (septiembre de 2008). "Diseño racional de vectores y modulación de múltiples vías de células HEK 293E producen títulos de anticuerpos recombinantes que superan 1 g/L mediante transfección transitoria en condiciones libres de suero" . Nucleic Acids Research . 36 (15): e96. doi : 10.1093/nar/gkn423 . PMC 2528171. PMID 18617574 .  {{cite journal}}: CS1 maint: varios nombres: lista de autores ( enlace )
  13. ↑ Daramola O, Stevenson J, Dean G, Hatton D, Pettman G, Holmes W, Field R (2014). "Un sistema transitorio CHO de alto rendimiento: la coexpresión de genes que codifican EBNA-1 y GS mejora la expresión transitoria de proteínas". Biotechnology Progress . 30 (1): 132– 141. doi : 10.1002/btpr.1809 . PMID 24106171 . S2CID 20068880 .  
  14. ↑ Silla T, Hääl I, Geimanen J, Janikson K, Abroi A, Ustav E, Ustav M (diciembre de 2005). "Mantenimiento episomal de plásmidos con orígenes híbridos en células de ratón" . Journal of Virology . 79 (24): 15277– 15288. doi : 10.1128/jvi.79.24.15277-15288.2005 . PMC 1316011. PMID 16306599 .  
  15. ↑ Codamo J, Munro TP, Hughes BS, Song M, Gray PP (junio de 2011). "Expresión génica transitoria mejorada basada en células CHO con el sistema de expresión epi-CHO". Molecular Biotechnology . 48 (2): 109– 115. doi : 10.1007/s12033-010-9351-9 . PMID 21104043. S2CID 42312966 .  
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  • Canto T (2016). «Sistemas de expresión transitoria en plantas: potencialidades y limitaciones». Tecnologías avanzadas para la producción y caracterización de complejos proteicos . Avances en medicina y biología experimental. Vol.  896. pp. 287–301 . doi : 10.1007/978-3-319-27216-0_18 . hdl : 10261/135535 . ISBN  978-3-319-27214-6. PMID 27165332 . 
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