Espectroscopia ultravioleta-visible

La espectrofotometría ultravioleta-visible ( UV-Vis o UV-VIS ) ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} se refiere a la espectroscopia de absorción o reflectancia en parte del ultravioleta y en la región visible completa y adyacente del espectro electromagnético . ^{[ 2 ]} Al ser relativamente económica y de fácil implementación, esta metodología se utiliza ampliamente en diversas aplicaciones aplicadas y fundamentales. El único requisito es que la muestra absorba en la región UV-Vis, es decir, que sea un cromóforo . La espectroscopia de absorción es complementaria a la espectroscopia de fluorescencia . Los parámetros de interés, además de la longitud de onda de medición, son la absorbancia (A), la transmitancia (%T) o la reflectancia (%R), y su variación con el tiempo. ^{[ 4 ] [ 5 ]}

Un espectrofotómetro UV-Vis es un instrumento analítico que mide la cantidad de luz ultravioleta (UV) y visible absorbida por una muestra. Es una técnica ampliamente utilizada en química, bioquímica y otros campos para identificar y cuantificar compuestos en diversas muestras. ^{[ 6 ]}

Los espectrofotómetros UV-Vis funcionan haciendo pasar un haz de luz a través de la muestra y midiendo la cantidad de luz absorbida en cada longitud de onda. La cantidad de luz absorbida es proporcional a la concentración del compuesto absorbente en la muestra.

La mayoría de las moléculas e iones absorben energía en el rango ultravioleta o visible, es decir, son cromóforos . El fotón absorbido excita un electrón en el cromóforo a orbitales moleculares de mayor energía, dando lugar a un estado excitado . ^{[ 7 ]} Para los cromóforos orgánicos, se asumen cuatro tipos posibles de transiciones: π–π*, n–π*, σ–σ* y n–σ*. Los complejos de metales de transición suelen ser coloreados (es decir, absorben luz visible) debido a la presencia de múltiples estados electrónicos asociados con orbitales d incompletamente llenos. ^{[ 5 ]}

La espectroscopia UV-Vis se puede utilizar para monitorizar cambios estructurales en el ADN. ^{[ 8 ]}

La espectroscopia UV-Vis se utiliza habitualmente en química analítica para la determinación cuantitativa de diversos analitos o muestras, como iones de metales de transición , compuestos orgánicos altamente conjugados y macromoléculas biológicas. El análisis espectroscópico se realiza comúnmente en disoluciones, pero también se pueden estudiar sólidos y gases.

• Los compuestos orgánicos , especialmente aquellos con un alto grado de conjugación , también absorben luz en las regiones UV o visible del espectro electromagnético . Los disolventes para estas determinaciones suelen ser agua para compuestos hidrosolubles o etanol para compuestos orgánicos solubles. (Los disolventes orgánicos pueden tener una absorción UV significativa; no todos los disolventes son adecuados para su uso en espectroscopia UV. El etanol absorbe muy débilmente en la mayoría de las longitudes de onda). La polaridad del disolvente y el pH pueden afectar el espectro de absorción de un compuesto orgánico. La tirosina , por ejemplo, aumenta en máximos de absorción y coeficiente de extinción molar cuando el pH aumenta de 6 a 13 o cuando disminuye la polaridad del disolvente.
• Si bien los complejos de transferencia de carga también dan lugar a colores, estos suelen ser demasiado intensos para ser utilizados en mediciones cuantitativas.

La ley de Beer-Lambert establece que la absorbancia de una disolución es directamente proporcional a la concentración de la especie absorbente en la disolución y a la longitud del camino óptico. ^{[ 9 ]} Por lo tanto, para una longitud de camino óptico fija, la espectroscopia UV-Vis puede utilizarse para determinar la concentración del absorbente en una disolución. Es necesario conocer la rapidez con la que cambia la absorbancia con la concentración. Esto puede obtenerse de referencias (tablas de coeficientes de extinción molar ) o, de forma más precisa, determinarse a partir de una curva de calibración .

Un espectrofotómetro UV-Vis puede utilizarse como detector para HPLC . La presencia de un analito produce una respuesta que se supone proporcional a su concentración. Para obtener resultados precisos, la respuesta del instrumento al analito en la muestra desconocida debe compararse con la respuesta a un estándar; esto es muy similar al uso de curvas de calibración. La respuesta (por ejemplo, la altura del pico) para una concentración determinada se conoce como factor de respuesta .

Las longitudes de onda de los picos de absorción pueden correlacionarse con los tipos de enlaces en una molécula dada y son valiosas para determinar los grupos funcionales dentro de una molécula. Las reglas de Woodward-Fieser , por ejemplo, son un conjunto de observaciones empíricas que se utilizan para predecir λ _max , la longitud de onda de la absorción UV-Vis más intensa, para compuestos orgánicos conjugados como dienos y cetonas . Sin embargo, el espectro por sí solo no es una prueba específica para una muestra dada. La naturaleza del disolvente, el pH de la solución, la temperatura, las altas concentraciones de electrolitos y la presencia de sustancias interferentes pueden influir en el espectro de absorción. Las variaciones experimentales, como el ancho de rendija (ancho de banda efectivo) del espectrofotómetro, también alterarán el espectro. Para aplicar la espectroscopia UV-Vis al análisis, estas variables deben controlarse o tenerse en cuenta para identificar las sustancias presentes. ^{[ 10 ]}

El método se utiliza con mayor frecuencia de forma cuantitativa para determinar concentraciones de una especie absorbente en solución, utilizando la ley de Beer-Lambert : ^{[ 11 ]}

${\displaystyle A=\log _{10}(I_{0}/I)=\varepsilon cL}$,

donde A es la absorbancia medida (formalmente adimensional pero generalmente se informa en unidades de absorbancia (UA) ^{[ 12 ]} ),${\displaystyle I_{0}}$es la intensidad de la luz incidente a una longitud de onda determinada ,${\displaystyle I}$es la intensidad transmitida, L la longitud del camino a través de la muestra y c la concentración de la especie absorbente. Para cada especie y longitud de onda, ε es una constante conocida como absortividad molar o coeficiente de extinción. Esta constante es una propiedad molecular fundamental en un disolvente dado, a una temperatura y presión particulares, y tiene unidades de${\displaystyle 1/M*cm}$.

La absorbancia y la extinción ε a veces se definen en términos del logaritmo natural en lugar del logaritmo en base 10.

La ley de Beer-Lambert es útil para caracterizar muchos compuestos, pero no constituye una relación universal para la concentración y absorción de todas las sustancias. En ocasiones, se observa una relación polinómica de segundo orden entre la absorción y la concentración ^{[ 13 ]} para moléculas muy grandes y complejas, como los colorantes orgánicos ( naranja de xilenol o rojo neutro , por ejemplo). ^{[ 14 ] [ 15 ]}

La espectroscopia UV-Vis también se utiliza en la industria de semiconductores para medir el espesor y las propiedades ópticas de películas delgadas en una oblea. Los espectrómetros UV-Vis se utilizan para medir la reflectancia de la luz y se pueden analizar mediante las ecuaciones de dispersión de Forouhi-Bloomer para determinar el índice de refracción (${\displaystyle n}$) y el coeficiente de extinción (${\displaystyle k}$) de una película determinada en todo el rango espectral medido. ^{[ 16 ]}

El instrumento utilizado en la espectroscopia ultravioleta-visible se llama espectrofotómetro UV-Vis. Mide la intensidad de la luz después de pasar a través de una muestra (${\displaystyle I}$), y la compara con la intensidad de la luz antes de que atraviese la muestra (${\displaystyle I_{o}}$). La proporción${\displaystyle I/I_{o}}$se llama transmitancia y se suele expresar como un porcentaje (%T). La absorbancia ,${\displaystyle A}$, se basa en la transmitancia:

${\displaystyle A=-\log(\%T/100\%)}$

El espectrofotómetro UV-visible también se puede configurar para medir la reflectancia. En este caso, el espectrofotómetro mide la intensidad de la luz reflejada por una muestra (${\displaystyle I}$), y la compara con la intensidad de la luz reflejada por un material de referencia (${\displaystyle I_{o}}$) (como una baldosa blanca). La proporción${\displaystyle I/I_{o}}$Se denomina reflectancia y se suele expresar como un porcentaje (%R).

Las partes básicas de un espectrofotómetro son una fuente de luz, un soporte para la muestra, una rejilla de difracción o un prisma como monocromador para separar las diferentes longitudes de onda de la luz, y un detector. La fuente de radiación suele ser un filamento de tungsteno (300–2500  nm), una lámpara de arco de deuterio , que es continua en la región ultravioleta (190–400  nm), una lámpara de arco de xenón , que es continua de 160 a 2000  nm; o, más recientemente, diodos emisores de luz (LED) ^{[ 4 ]} para las longitudes de onda visibles. El detector suele ser un tubo fotomultiplicador , un fotodiodo , una matriz de fotodiodos o un dispositivo de carga acoplada (CCD). Los detectores de fotodiodo único y los tubos fotomultiplicadores se utilizan con monocromadores de barrido, que filtran la luz de modo que solo la luz de una única longitud de onda llegue al detector a la vez. El monocromador de barrido desplaza la rejilla de difracción para "recorrer" cada longitud de onda, de modo que su intensidad pueda medirse en función de la longitud de onda. Los monocromadores fijos se utilizan con CCD y matrices de fotodiodos. Dado que ambos dispositivos constan de numerosos detectores agrupados en matrices unidimensionales o bidimensionales, pueden captar luz de diferentes longitudes de onda en distintos píxeles o grupos de píxeles simultáneamente.

Un espectrofotómetro puede ser de haz simple o de doble haz . En un instrumento de haz simple (como el Spectronic 20 ), toda la luz pasa a través de la celda de muestra.${\displaystyle I_{o}}$Debe medirse extrayendo la muestra. Este fue el diseño original y todavía se usa comúnmente tanto en la enseñanza como en laboratorios industriales.

En un instrumento de doble haz, la luz se divide en dos haces antes de llegar a la muestra. Un haz se utiliza como referencia; el otro atraviesa la muestra. La intensidad del haz de referencia se considera como 100 % de transmisión (o 0 % de absorbancia), y la medición mostrada es la relación entre las intensidades de ambos haces. Algunos instrumentos de doble haz tienen dos detectores (fotodiodos), y el haz de muestra y el de referencia se miden simultáneamente. En otros instrumentos, los dos haces pasan a través de un modulador de haz , que bloquea un haz a la vez. El detector alterna entre medir el haz de muestra y el de referencia en sincronismo con el modulador. También puede haber uno o más intervalos de oscuridad en el ciclo del modulador. En este caso, las intensidades de haz medidas se pueden corregir restando la intensidad medida en el intervalo de oscuridad antes de calcular la relación.

En un instrumento de haz único, primero se debe medir la cubeta que contiene solo el disolvente. Mettler Toledo desarrolló un espectrofotómetro de matriz de haz único que permite mediciones rápidas y precisas en el rango UV-Vis. La fuente de luz consiste en una lámpara de destello de xenón para las regiones ultravioleta (UV), visible (VIS) e infrarroja cercana, cubriendo un rango espectral de 190 a 1100  nm. Los destellos de la lámpara se enfocan en una fibra de vidrio que dirige el haz de luz hacia una cubeta que contiene la solución de muestra. El haz atraviesa la muestra y las longitudes de onda específicas son absorbidas por los componentes de la muestra. La luz restante se recoge después de la cubeta mediante una fibra de vidrio y se dirige a un espectrógrafo. El espectrógrafo consta de una rejilla de difracción que separa la luz en diferentes longitudes de onda y un sensor CCD para registrar los datos. De esta manera, se mide simultáneamente todo el espectro, lo que permite un registro rápido. ^{[ 25 ]}

Las muestras para espectrofotometría UV-Vis suelen ser líquidos, aunque también se puede medir la absorbancia de gases e incluso de sólidos. Las muestras se colocan típicamente en una celda transparente , conocida como cubeta . Las cubetas suelen ser de forma rectangular, comúnmente con un ancho interno de 1  cm. (Este ancho se convierte en la longitud del camino óptico,${\displaystyle L}$(en la ley de Beer-Lambert). Los tubos de ensayo también pueden usarse como cubetas en algunos instrumentos. El tipo de recipiente de muestra utilizado debe permitir el paso de la radiación a través de la región espectral de interés. Las cubetas más utilizadas son las de sílice fundida o vidrio de cuarzo de alta calidad , ya que son transparentes en las regiones ultravioleta, visible e infrarroja cercana. Las cubetas de vidrio y plástico también son comunes, aunque el vidrio y la mayoría de los plásticos absorben en el ultravioleta, lo que limita su utilidad a las longitudes de onda visibles. ^{[ 4 ]}

También se han fabricado instrumentos especializados. Entre ellos se incluyen espectrofotómetros acoplados a telescopios para medir los espectros de objetos astronómicos. Los microespectrofotómetros UV-visible constan de un microscopio UV-visible integrado con un espectrofotómetro UV-visible.

Un espectrofotómetro más sofisticado permite obtener directamente un espectro completo de absorción en todas las longitudes de onda de interés. En instrumentos más sencillos, la absorción se determina longitud de onda por longitud de onda y el operador la compila en un espectro. Al eliminar la dependencia de la concentración, se puede determinar el coeficiente de extinción (ε) en función de la longitud de onda.

La espectroscopia UV-visible de muestras microscópicas se realiza integrando un microscopio óptico con óptica UV-visible, fuentes de luz blanca, un monocromador y un detector sensible como un dispositivo de carga acoplada (CCD) o un tubo fotomultiplicador (PMT). Dado que solo se dispone de una única trayectoria óptica, se trata de instrumentos de haz único. Los instrumentos modernos son capaces de medir espectros UV-visible tanto en reflectancia como en transmitancia de áreas de muestreo a escala micrométrica. Las ventajas de utilizar estos instrumentos radican en que pueden medir muestras microscópicas, pero también los espectros de muestras más grandes con alta resolución espacial. Por ello, se utilizan en el laboratorio forense para analizar tintes y pigmentos en fibras textiles individuales, ^{[ 26 ]} fragmentos de pintura microscópicos ^{[ 27 ]} y el color de fragmentos de vidrio. También se emplean en ciencia de materiales e investigación biológica, así como para determinar el contenido energético de la roca madre de carbón y petróleo mediante la medición de la reflectancia de la vitrinita . Los microespectrofotómetros se utilizan en las industrias de semiconductores y microóptica para monitorizar el espesor de películas delgadas tras su deposición. En la industria de semiconductores, se emplean debido a que las dimensiones críticas de los circuitos son microscópicas. Una prueba típica de una oblea semiconductora implica la adquisición de espectros de múltiples puntos en una oblea con o sin patrón. El espesor de las películas depositadas se puede calcular a partir del patrón de interferencia de los espectros. Además, la espectrofotometría ultravioleta-visible permite determinar el espesor, junto con el índice de refracción y el coeficiente de extinción de las películas delgadas. ^{[ 16 ]} Posteriormente, se puede generar un mapa del espesor de la película en toda la oblea para su uso en el control de calidad. ^{[ 28 ]}

La espectroscopia UV-Vis puede aplicarse para caracterizar la velocidad de una reacción química . Un ejemplo ilustrativo es la conversión de los isómeros amarillo-naranja y azul del ditizonato de mercurio. Este método de análisis se basa en el hecho de que la concentración es linealmente proporcional a la concentración. De la misma manera, permite determinar los equilibrios entre cromóforos. ^{[ 29 ] [ 30 ]}

A partir del espectro de gases de combustión, es posible determinar la composición química de un combustible, la temperatura de los gases y la relación aire-combustible. ^{[ 31 ]}

• Espectroscopia aplicada
• Método de Benesi-Hildebrand
• Espectroscopia color - visible con el ojo humano 
• espectroscopia de modulación de carga
• Espectrofotómetro DU : el primer instrumento UV-Vis.
• espectroscopia de transformada de Fourier
• La espectroscopia infrarroja y la espectroscopia Raman son otras técnicas espectroscópicas comunes, que se utilizan habitualmente para obtener información sobre la estructura de los compuestos o para identificarlos. Ambas son formas de espectroscopia vibracional .
• Punto isosbéstico : longitud de onda donde la absorción no cambia a medida que avanza la reacción. Es importante en las mediciones cinéticas como punto de control.
• Espectroscopia de infrarrojo cercano
• Espectroscopia rotacional
• Espectroscopia de pendiente
• Espectroscopia ultravioleta-visible de estereoisómeros
• Espectroscopia vibracional