Tinte sensible al voltaje

Los colorantes sensibles al voltaje , también conocidos como colorantes potenciométricos , son colorantes que modifican sus propiedades espectrales en respuesta a cambios de voltaje . ^{[ 1 ]} Permiten realizar mediciones lineales de la actividad de disparo de neuronas individuales , grandes poblaciones neuronales o la actividad de miocitos . Muchos procesos fisiológicos se acompañan de cambios en el potencial de membrana celular , los cuales pueden detectarse con colorantes sensibles al voltaje. Las mediciones pueden indicar el sitio de origen del potencial de acción , y se pueden obtener mediciones de su velocidad y dirección. ^{[ 2 ]}

Los colorantes potenciométricos se utilizan para monitorizar la actividad eléctrica dentro de los orgánulos celulares donde no es posible insertar un electrodo , como las mitocondrias y las espinas dendríticas . Esta tecnología es especialmente útil para el estudio de patrones de actividad en preparaciones multicelulares complejas. Además, permite medir las variaciones espaciales y temporales del potencial de membrana a lo largo de la superficie de células individuales.

Sondas de respuesta rápida: Se trata de colorantes de membrana anfifílicos que suelen tener un par de cadenas de hidrocarburos que actúan como anclajes a la membrana y un grupo hidrófilo que alinea el cromóforo perpendicularmente a la interfaz membrana/agua. Se cree que el cromóforo experimenta un gran desplazamiento de carga electrónica como resultado de la excitación del estado fundamental al estado excitado , lo que subyace al supuesto mecanismo electrocrómico de la sensibilidad de estos colorantes al potencial de membrana. Esta molécula (colorante) se intercala entre la parte lipofílica de las membranas biológicas . Esta orientación asegura que la redistribución de carga inducida por la excitación se produzca paralelamente al campo eléctrico dentro de la membrana. Por lo tanto, un cambio en el voltaje a través de la membrana provocará un desplazamiento espectral resultante de una interacción directa entre el campo y los momentos dipolares del estado fundamental y excitado .

Los nuevos colorantes de voltaje pueden detectar voltaje con alta velocidad y sensibilidad mediante transferencia de electrones fotoinducida (PeT) a través de un cable molecular conjugado . ^{[ 3 ] [ 4 ]}

Sondas de respuesta lenta: Estas presentan cambios dependientes del potencial en su distribución transmembrana, los cuales van acompañados de un cambio en la fluorescencia. Las sondas de respuesta lenta típicas incluyen carbocianinas y rodaminas catiónicas , y oxonoles iónicos .

Los colorantes sensibles al voltaje comúnmente utilizados son los colorantes de aminonaftiletenilpiridinio (ANEP) sustituidos, como di-4-ANEPPS, di-8-ANEPPS y RH237. Dependiendo de sus modificaciones químicas que cambian sus propiedades físicas, se utilizan para diferentes procedimientos experimentales. ^{[ 5 ]} Fueron descritos por primera vez en 1985 por el grupo de investigación de Leslie Loew. ^{[ 6 ]} ANNINE-6plus es un colorante sensible al voltaje con respuesta rápida ( tiempo de respuesta de ns ) y alta sensibilidad. Ha sido aplicado para medir los potenciales de acción de un solo túbulo t de cardiomiocitos por Guixue Bu et al. ^{[ 7 ]} Más recientemente, se introdujo una serie de colorantes ANEP fluorados que ofrecen sensibilidad y fotoestabilidad mejoradas; también están disponibles en una amplia gama de longitudes de onda de excitación y emisión. ^{[ 8 ]} Un estudio computacional reciente confirmó que los colorantes ANEP se ven afectados solo por el entorno electrostático y no por interacciones moleculares específicas. ^{[ 9 ]} Otros andamios estructurales, como los xantenos, ^{[ 10 ]} también se utilizan con éxito.

El material fundamental para la obtención de imágenes de la actividad cerebral con colorantes sensibles al voltaje son los propios colorantes. Estos colorantes son lipofílicos y se localizan preferentemente en las membranas gracias a sus colas hidrofóbicas. Se utilizan en aplicaciones que implican fluorescencia o absorción; actúan con rapidez y permiten realizar mediciones lineales de los cambios en el potencial de membrana. ^{[ 11 ]} Numerosas empresas que ofrecen sondas fluorescentes para aplicaciones biológicas suministran colorantes sensibles al voltaje . Potentiometric Probes, LLC se especializa exclusivamente en colorantes sensibles al voltaje y posee una licencia exclusiva para distribuir la amplia gama de colorantes sensibles al voltaje fluorados, comercializados bajo la marca ElectroFluor.

Se puede utilizar una variedad de equipos especializados junto con los colorantes, y la elección de los mismos variará según las particularidades de cada preparación. Básicamente, el equipo incluirá microscopios y dispositivos de imagen especializados, y puede incluir lámparas técnicas o láseres. ^{[ 11 ]}

Entre las ventajas de la obtención de imágenes de la actividad cerebral con colorantes sensibles al voltaje se incluyen las siguientes capacidades:

• Es posible registrar simultáneamente la medición de señales poblacionales de muchas áreas, y se pueden registrar cientos de neuronas. Estos registros multisitio pueden proporcionar información precisa sobre la iniciación y propagación del potencial de acción (incluidas la dirección y la velocidad), y sobre toda la estructura ramificada de una neurona. ^{[ 11 ]}
• Se pueden tomar mediciones de la actividad de los potenciales de acción en un ganglio que está produciendo un comportamiento y pueden proporcionar información sobre cómo se produce dicho comportamiento. ^{[ 11 ]}
• En ciertas preparaciones, los efectos farmacológicos de los colorantes pueden revertirse completamente retirando la pipeta de tinción y dejando que la neurona se recupere durante 1-2 horas. ^{[ 11 ]}
• Los colorantes pueden utilizarse para analizar la integración de señales en las ramificaciones dendríticas terminales. Los colorantes sensibles al voltaje ofrecen la única alternativa a las proteínas sensibles al voltaje codificadas genéticamente (como las proteínas derivadas de Ci-VSP ) para este fin. ^{[ 11 ]}
• Los colorantes más solubles, como ElectroFluor-530s o di-2-ANEPEQ, pueden perfundirse internamente en células individuales mediante una micropipeta de parche. Esta técnica ha permitido el estudio de señales eléctricas en dendritas individuales ^{[ 12 ] [ 13 ]} y espinas dendríticas ^{[ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]} dentro de cortes cerebrales.

Las limitaciones de la obtención de imágenes de la actividad cerebral con colorantes sensibles al voltaje incluyen los siguientes problemas:

• Los colorantes sensibles al voltaje pueden responder de manera muy diferente de una preparación a otra; normalmente se deben probar decenas de colorantes para obtener una señal óptima. ^{[ 11 ]} Los parámetros de imagen, como la longitud de onda de excitación, la longitud de onda de emisión y el tiempo de exposición, también deben optimizarse.
• Los colorantes sensibles al voltaje a menudo no logran penetrar el tejido conectivo ni moverse a través de los espacios intracelulares hasta la región de la membrana que se desea estudiar. ^{[ 11 ]} La tinción es un problema grave en las aplicaciones de estos colorantes. Los colorantes solubles en agua, como ANNINE-6plus , ElectroFluor-530s o di-2-ANEPEQ , no presentan este problema.
• Por otro lado, si los colorantes son demasiado solubles en agua, la tinción puede no ser persistente. Esto se puede solucionar utilizando colorantes con cadenas alquílicas más largas para aumentar la lipofilicidad .
• El ruido es un problema en todas las preparaciones con colorantes sensibles al voltaje y, en algunas, la señal puede verse significativamente atenuada. ^{[ 11 ]} La relación señal/ruido puede mejorarse con algoritmos de filtrado espacial o temporal. Existen muchos algoritmos de este tipo; un algoritmo de procesamiento de señales se puede encontrar en un trabajo reciente con el colorante ANNINE-6plus. ^{[ 7 ]}
• Las células pueden verse afectadas permanentemente por los tratamientos. Son posibles efectos farmacológicos duraderos, y la fotodinámica de los colorantes puede ser dañina. ^{[ 11 ]} Se ha demostrado que los colorantes fluorados sensibles al voltaje desarrollados recientemente mitigan estos efectos. ^{[ 8 ] [ 18 ]}

Se han utilizado colorantes sensibles al voltaje para medir la actividad neuronal en varias áreas del sistema nervioso en diversos organismos, incluyendo el axón gigante del calamar , ^{[ 19 ]} los barriles de los bigotes de la corteza somatosensorial de la rata, ^{[ 20 ] [ 21 ]} el bulbo olfatorio de la salamandra, ^{[ 22 ] [ 23 ] [ 24 ]} la corteza visual del gato, ^{[ 25 ]} el tectum óptico de la rana, ^{[ 26 ]} y la corteza visual del mono rhesus . ^{[ 27 ] [ 28 ]}

Se han publicado muchas aplicaciones en electrofisiología cardíaca, incluyendo el mapeo ex vivo de la actividad eléctrica en corazones completos de varias especies animales, ^{[ 29 ] [ 30 ]} imágenes subcelulares de cardiomiocitos individuales, ^{[ 31 ]} e incluso el mapeo de ritmos sinusales y arritmias en cerdos in vivo con corazón abierto , ^{[ 18 ]} donde los artefactos de movimiento podrían eliminarse mediante imágenes de relación de longitud de onda dual de la fluorescencia del colorante sensible al voltaje.