xADN

El xADN (también conocido como ADN expandido o ADN benzo-homologado ) es un sistema de nucleótidos expandido en tamaño sintetizado a partir de la fusión de un anillo de benceno y una de las cuatro bases naturales: adenina , guanina , citosina y timina . ^[1] Esta expansión de tamaño produce un alfabeto de 8 letras que tiene una mayor capacidad de almacenamiento de información que el alfabeto de 4 letras del ADN natural (a menudo denominado B-ADN en la literatura). ^[2] Al igual que con el apareamiento de bases normal , A se empareja con xT, C se empareja con xG, G se empareja con xC y T se empareja con xA. La doble hélice es, por tanto, 2,4 Å más ancha que una doble hélice natural. ^{[3] [4]} Aunque es similar en estructura al B-ADN, el xADN tiene propiedades únicas de absorción, fluorescencia y apilamiento. ^{[5] [6] [7]}

Inicialmente sintetizada como una sonda enzimática por el grupo de Nelson J. Leonard, la adenina benzo-homologada fue la primera base sintetizada. Más tarde, el grupo de Eric T. Kool terminó de sintetizar las tres bases expandidas restantes , seguidas eventualmente por yDNA (ADN "ancho"), otro sistema de nucleótidos benzo-homologado y xxDNA e yyDNA nafto -homologado. El xDNA es más estable en comparación con el ADN regular cuando se somete a temperaturas más altas, y aunque existen cadenas enteras de xDNA, yDNA, xxDNA e yyDNA, actualmente son difíciles de sintetizar y mantener. Los experimentos con xDNA proporcionan una nueva perspectiva sobre el comportamiento del B-ADN natural. Las bases extendidas xA, xC, xG y xT son naturalmente fluorescentes , y las cadenas simples compuestas solo por bases extendidas pueden reconocer y unirse a cadenas simples de ADN natural, lo que las convierte en herramientas útiles para estudiar sistemas biológicos. ^{[3] [8]} El xADN se forma más comúnmente con pares de bases entre una nucleobase natural y una expandida , sin embargo las x-nucleobases también pueden emparejarse entre sí. ^[5] La investigación actual respalda al xADN como un sistema de codificación genética viable en el futuro cercano. ^[4]

El primer nucleótido que se expandió fue la purina adenina . Nelson J. Leonard y sus colegas sintetizaron este nucleótido x original, al que se denominó "adenina expandida". xA se utilizó como sonda en la investigación de los sitios activos de las enzimas dependientes de ATP , más específicamente qué modificaciones podría aceptar el sustrato sin dejar de ser funcional. ^{[8] [9]} Casi dos décadas después, las otras tres bases se expandieron con éxito y luego se integraron en una doble hélice por Eric T. Kool y sus colegas. Su objetivo era crear un sistema genético sintético que imitara y superara las funciones del sistema genético natural, ^[10] y ampliar las aplicaciones del ADN tanto en células vivas como en bioquímica experimental . Una vez creado el conjunto de bases expandido, el objetivo pasó a identificar o desarrollar enzimas de replicación fieles y optimizar aún más el alfabeto de ADN expandido. ^[8]

En las purinas benzo-homologadas (xA y xG), el anillo de benceno está unido a la base nitrogenada a través de enlaces nitrógeno-carbono (NC). Las pirimidinas benzo-homologadas se forman a través de enlaces carbono-carbono (CC) entre la base y el benceno. ^[3] Hasta ahora, se han añadido x-nucleobases a cadenas de ADN utilizando derivados de fosforamidita , ya que las polimerasas tradicionales no han tenido éxito en la síntesis de cadenas de xADN. Los nucleótidos X son malos candidatos como sustratos para las polimerasas B-ADN ya que su tamaño interfiere con la unión en el dominio catalítico . Los intentos de utilizar enzimas independientes de la plantilla han tenido éxito ya que tienen una restricción geométrica reducida para los sustratos. La desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT) se ha utilizado anteriormente para sintetizar cadenas de bases que se han unido a fluoróforos . Utilizando TdT , se pueden combinar hasta 30 monómeros para formar una doble hélice de ADNx, sin embargo, este ADNx oligomérico parece inhibir su propia extensión más allá de esta longitud debido a la abrumadora unión de hidrógeno. Para minimizar la inhibición, el ADNx se puede hibridar en una hélice regular. ^{[7] [11]}

Para que el xADN se pueda utilizar como estructura sustitutiva para el almacenamiento de información, se requiere un mecanismo de replicación fiable. Las investigaciones sobre la replicación del xADN utilizando un fragmento Klenow de la ADN polimerasa I muestran que se añade selectivamente una pareja de base natural en casos de inserción de un solo nucleótido. Sin embargo, la ADN polimerasa IV (Dpo4) ha podido utilizar con éxito el xADN para este tipo de inserciones con alta fidelidad, lo que lo convierte en un candidato prometedor para futuras investigaciones en la extensión de réplicas del xADN. ^[4] La sensibilidad del xADN a los desajustes es similar a la del B-ADN . ^[2]

De manera similar a las bases naturales, los nucleótidos x se ensamblan selectivamente en una estructura dúplex que se asemeja al ADN-B. ^[4] El ADN-x se sintetizó originalmente incorporando un anillo de benceno en la base nitrogenada. Sin embargo, otras bases expandidas también han podido incorporar tiofeno y benzo[b]tiofeno . El ADN-x y el ADN-y utilizan anillos de benceno para ensanchar las bases y, por lo tanto, se denominan "benzo-homologados". Otra forma de nucleobases expandidas conocidas como ADN-yy incorporan naftaleno en la base y están "nafto-homologadas". El ADN-x tiene una elevación de 3,2 Å y un giro de 32°, significativamente menor que el ADN-B, que tiene una elevación de 3,3 Å y un giro de 34,2° ^[3] Los nucleótidos del ADN-x pueden aparecer en ambas hebras, ya sea solos (conocidos como "ADN doblemente expandido" ^[8] ) o mezclados con bases naturales, o exclusivamente en una hebra o en la otra. De manera similar al B-ADN, el xADN puede reconocer y unirse a secuencias complementarias de ADN o ARN monocatenario . ^[2]

Los dúplex formados a partir de xDNA son similares a los dúplex naturales, aparte de la distancia entre las dos cadenas principales de azúcar-fosfato. Las hélices de xDNA tienen un mayor número de pares de bases por vuelta de la hélice como resultado de una distancia reducida entre los nucleótidos vecinos. Los espectros de RMN informan que las hélices de xDNA son antiparalelas, dextrógiras y toman una conformación anti alrededor del enlace glucosídico , con un fruncido de azúcar C2'-endo. ^{[5] [11]} Las hélices creadas a partir de xDNA tienen más probabilidades de tomar una conformación de hélice B en lugar de una de hélice A, ^[2] y tienen un ancho de surco mayor aumentado en 6,5 Å (donde las cadenas principales están más separadas) y un ancho de surco menor disminuido en 5,5 Å (donde las cadenas principales están más juntas) en comparación con B-DNA . La alteración del ancho del surco afecta la capacidad del xADN de asociarse con proteínas de unión al ADN , ^[12] pero mientras los nucleótidos expandidos sean exclusivos de una cadena, los sitios de reconocimiento son suficientemente similares al B-ADN para permitir la unión de factores de transcripción y pequeñas moléculas de poliamida . Las hélices mixtas presentan la posibilidad de reconocer las cuatro bases expandidas utilizando otras moléculas de unión al ADN. ^[11]

Los nucleótidos expandidos y sus hélices oligoméricas comparten muchas propiedades con sus contrapartes naturales de ADN-B , incluyendo su preferencia de emparejamiento: A con T , C con G. ^[11] Las diversas diferencias en las propiedades químicas entre el ADN-x y el ADN-B apoyan la hipótesis de que el anillo de benceno que expande las nucleobases x no es, de hecho, químicamente inerte. ^[5] El ADN-x es más hidrófobo que el ADN-B , ^[7] y también tiene una brecha HOMO-LUMO más pequeña (distancia entre el orbital molecular ocupado más alto y el orbital molecular desocupado más bajo) como resultado de la saturación modificada . ^[3] El ADN-x tiene temperaturas de fusión más altas que el ADN-B (un decámero mixto de xA y T tiene una temperatura de fusión de 55,6 °C, 34,3 °C más alta que el mismo decámero de A y T ^[11] ), y exhibe un comportamiento de fusión de "todo o nada". ^[2]

En condiciones de laboratorio, el xADN se orienta en la conformación syn . Desafortunadamente, esto no expone la cara de unión de los nucleótidos del xADN para que quede de cara a la hebra vecina para la unión, lo que significa que se deben aplicar medidas adicionales para alterar la conformación del xADN antes de intentar formar hélices. Sin embargo, las orientaciones anti y syn son prácticamente idénticas energéticamente en las bases expandidas. ^[9] Esta preferencia conformacional se observa principalmente en las pirimidinas , y las purinas muestran una preferencia mínima por la orientación. ^[5]

El apilamiento de los nucleótidos en una doble hélice es un determinante importante de la estabilidad de la hélice. Con la superficie adicional y el hidrógeno disponible para la unión, el potencial de apilamiento de las nucleobases aumenta con la adición de un espaciador de benceno . Al aumentar la separación entre las bases nitrogenadas y cualquiera de las cadenas principales de azúcar y fosfato, la energía de apilamiento de la hélice es menos variable y, por lo tanto, más estable. Las energías para los pares de nucleobases naturales varían de 18 a 52 kJ/mol. Esta variación es de solo 14–40 kJ/mol para el xADN. ^[8]

Debido a una mayor superposición entre una cadena de ADN expandida y su cadena vecina, hay mayores interacciones entre cadenas en hélices expandidas y mixtas, lo que resulta en un aumento significativo en la estabilidad de la hélice. El xADN tiene capacidades de apilamiento mejoradas resultantes de cambios en los enlaces de hidrógeno entre cadenas y dentro de ellas que surgen de la adición de un espaciador de benceno , pero la expansión de las bases no altera la contribución del hidrógeno a la estabilidad del dúplex. Estas capacidades de apilamiento son explotadas por hélices que consisten tanto en xADN como en B-ADN para optimizar la fuerza de la hélice. El aumento del apilamiento se ve más prominentemente en cadenas que consisten solo en A y xA y T y xT, ya que T -xA tiene interacciones de apilamiento más fuertes que T - A. [ ^3]

La energía resultante de las pirimidinas varía de 30 a 49 kJ/mol. El rango para las purinas está entre 40-58 kJ/mol. Al reemplazar un nucleótido en una doble hélice con un nucleótido expandido, la fuerza de las interacciones de apilamiento aumenta en un 50%. Expandir ambos nucleótidos da como resultado un aumento del 90% en la fuerza de apilamiento. Si bien xG tiene un efecto negativo general en la fuerza de unión de la hélice, las otras tres bases expandidas lo compensan con sus efectos positivos. El cambio en la energía causado por expandir las bases depende principalmente de la rotación del enlace alrededor de los centros de masa de las nucleobases , y las interacciones de apilamiento del centro de masa mejoran el potencial de apilamiento de la hélice. ^[5] Debido a que las bases expandidas por tamaño ensanchan la hélice, es más estable térmicamente con una temperatura de fusión más alta. ^[7]

La adición de un espaciador de benceno en las nucleobases x afecta los espectros de absorción óptica de las bases . La teoría funcional de la densidad dependiente del tiempo (TDDFT) aplicada al xDNA reveló que el componente de benceno de los orbitales moleculares ocupados más altos ( HOMO ) en las bases x fija el inicio de la absorción en un punto anterior que las bases naturales . Otra característica inusual de los espectros de absorción del xDNA son los excímeros desplazados al rojo de xA en el rango bajo. En términos de huellas dactilares de apilamiento, hay una hipocromicidad más pronunciada observada en pares de bases xA- T consecutivos .

Las implicaciones de la absorción alterada del xADN incluyen aplicaciones en tecnología nanoelectrónica y nanobiotecnología . El espaciamiento reducido entre los nucleótidos x hace que la hélice sea más rígida, por lo que no se ve afectada tan fácilmente por las fuerzas del sustrato , el electrodo y las nanopartículas funcionales . Otras alteraciones de los nucleótidos naturales que resultan en diferentes espectros de absorción ampliarán estas aplicaciones en el futuro. ^[6]

Una propiedad única del xADN es su fluorescencia inherente . Las bases naturales se pueden unir directamente a fluoróforos para su uso en microarrays , hibridación in situ y análisis de polimorfismos . Sin embargo, estas bases naturales fluorescentes a menudo fallan como resultado de la autoextinción , lo que disminuye su intensidad fluorescente y reduce su aplicabilidad como etiquetas visuales de ADN. Las interacciones pi entre los anillos en las x-nucleobases dan como resultado una fluorescencia inherente en el rango violeta-azul, con un desplazamiento de Stokes entre 50 y 80 nm. También tienen un rendimiento cuántico en el rango de 0,3 a 0,6. xC tiene la mayor emisión fluorescente. ^{[10] [7]}

Después de la creación y la investigación exitosa en torno al xADN, se investigaron más formas de nucleótidos expandidos. El yADN es un segundo sistema de nucleótidos similar que utiliza un anillo de benceno para expandir las cuatro bases naturales . El xxADN y el yyADN utilizan naftaleno , una molécula policíclica que consta de dos anillos de hidrocarburos . Los dos anillos expanden la base aún más, alterando aún más sus propiedades químicas.

El éxito y las implicaciones del xDNA impulsaron la investigación para examinar otros factores que podrían alterar las propiedades químicas del B-DNA y crear un nuevo sistema para el almacenamiento de información con aplicaciones más amplias. El yDNA también utiliza un anillo de benceno , similar al xDNA, con la única diferencia de ser el sitio de adición del anillo aromático . La ubicación del anillo de benceno cambia la estructura preferida de la hélice expandida. La conformación alterada hace que el yDNA sea más similar al B-DNA en su orientación al cambiar los enlaces de hidrógeno entre cadenas . La estabilidad depende en gran medida de la rotación de las bases sobre el enlace entre la base y el azúcar de la cadena principal. La preferencia alterada del yDNA por esta orientación lo hace más estable en general que el xDNA. La ubicación del espaciador de benceno también afecta la geometría del surco de las bases, alterando las interacciones vecinas. Los pares de bases entre los nucleótidos y y los nucleótidos naturales son planos, en lugar de ligeramente retorcidos como con el xDNA. Esto disminuye el ascenso de la hélice incluso más de lo que se logra con el xDNA.

Si bien el xDNA y el yDNA son bastante similares en la mayoría de las propiedades, incluidas sus interacciones de apilamiento incrementadas, el yDNA muestra un reconocimiento de desajustes superior. Las y-pirimidinas muestran interacciones de apilamiento ligeramente más fuertes que las x-pirimidinas como resultado de la distancia entre los dos carbonos anoméricos , que es ligeramente mayor en el yDNA. El xDNA todavía tiene interacciones de apilamiento más fuertes en hélices modelo, pero agregar x- o y-pirimidinas a una doble hélice natural fortalece las interacciones intra e intercatenarias, lo que aumenta la estabilidad general de la hélice. Al final, cuál de los dos tiene las interacciones de apilamiento generales más fuertes depende de la secuencia ; xT e yT se unen a A con una fuerza similar, pero la energía de apilamiento de yC unido a G es más fuerte que xC en 4kJ/mol. El yDNA y otras bases expandidas son parte de un campo muy joven que está muy poco estudiado. Las investigaciones sugieren que la conformación ideal aún queda por descubrir, pero saber que la ubicación del benceno afecta la orientación y la estructura de las nucleobases expandidas agrega información para su diseño futuro. ^[8]

Las nucleobases doblemente expandidas (o nafto-homologadas ) incorporan un espaciador de naftaleno en lugar de un anillo de benceno , ensanchando la base el doble con su estructura de dos anillos. Estas estructuras (conocidas como xxDNA e yyDNA) son 4,8 Å más anchas que las bases naturales y se crearon una vez más como resultado de la investigación de Leonard sobre la adenina expandida en enzimas dependientes de ATP en 1984. No se publicó literatura sobre estas bases doblemente expandidas durante casi tres décadas hasta 2013, cuando Sharma, Lait y Wetmore produjeron la primera xxG y la incorporaron junto con xxA en una hélice natural . Aunque se ha realizado muy poca investigación sobre xxDNA, ya se ha demostrado que los vecinos xx- purina aumentan la energía de apilamiento intracatenario hasta en un 119% (a diferencia del 62% en x-purinas). Las interacciones de xx- purinas y pirimidinas muestran una disminución general en las energías de apilamiento, pero la estabilidad general de los dúplex que incluyen pirimidinas y xx-purinas aumenta en un 22%, más del doble que la de las pirimidinas y x-purinas. ^[9]

El xDNA tiene muchas aplicaciones en la investigación química y biológica, incluida la expansión de las aplicaciones del ADN natural , como el andamiaje. Para crear nanoestructuras autoensamblables, se necesita un andamio como una especie de enrejado para sostener el crecimiento. El ADN se ha utilizado como un medio para este fin en el pasado, pero los andamios expandidos hacen que los andamios más grandes para un autoensamblaje más complejo sean una opción. ^{[1] Las propiedades} de conducción eléctrica del xDNA también lo convierten en un candidato principal como cable molecular , ya que sus interacciones π-π lo ayudan a conducir electricidad de manera eficiente. ^[3] Su alfabeto de 8 letras ( A , T , C , G , xA, xT, xC, xG) le da el potencial de almacenar 2 ⁿ veces más estados por secuencia que el ADN, donde n es el número de bases en la secuencia. Por ejemplo, la combinación de 6 nucleótidos de B-ADN produce 4096 secuencias posibles, mientras que una combinación del mismo número de nucleótidos creada con xADN produce 262.144 secuencias posibles. Además, el xADN se puede utilizar como sonda fluorescente en sitios activos de enzimas , como fue su aplicación original por Leonard et al. ^[2]

El xDNA también se ha aplicado al estudio de las interacciones proteína-ADN . Debido a las propiedades fluorescentes naturales del xDNA , se puede visualizar fácilmente tanto en condiciones de laboratorio como en vivo. ^[5] El xDNA es cada vez más fácil de crear y oligomerizar , y su unión de alta afinidad a secuencias complementarias de ADN y ARN significa que no solo puede ayudar a localizar estas secuencias flotando en la célula, sino también cuando ya están interactuando con otras estructuras dentro de la célula. ^[10] El xDNA también tiene aplicaciones potenciales en ensayos que emplean TdT , ya que puede mejorar los reporteros y se puede utilizar como una etiqueta de afinidad para la unión entre cadenas. ^[7]

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