Hispanopedia Wiki
Articulo de referencia

proteína fluorescente verde

La proteína verde fluorescente ( GFP ) es una proteína que presenta fluorescencia verde al exponerse a la luz en el rango azul a ultravioleta . [ 2 ] [ 3 ] La denominación GFP s...

Hispanopedia WikiContenido en espanolLectura gratuita

La proteína verde fluorescente ( GFP ) es una proteína que presenta fluorescencia verde al exponerse a la luz en el rango azul a ultravioleta . [ 2 ] [ 3 ] La denominación GFP se refiere tradicionalmente a la proteína aislada por primera vez de la medusa Aequorea victoria y a veces se la denomina avGFP . Sin embargo, se han encontrado GFP en otros organismos, como corales , anémonas de mar , zoántidos , copépodos y anfioxos . [ 4 ]

La GFP de A. victoria tiene un pico de excitación principal a una longitud de onda de 395  nm y uno menor a 475  nm. Su pico de emisión se encuentra a 509  nm, que está en la porción verde inferior del espectro visible . El rendimiento cuántico de fluorescencia (QY) de la GFP es de 0,79. La GFP de la Renilla reniformis tiene un único pico de excitación principal a 498  nm. La GFP es una excelente herramienta en muchas áreas de la biología debido a su capacidad para formar un cromóforo interno sin requerir cofactores accesorios , productos génicos o enzimas / sustratos distintos del oxígeno molecular. [ 5 ] [ 6 ]

En biología celular y molecular , el gen GFP se usa frecuentemente como reportero de expresión . [ 7 ] Se ha usado en formas modificadas para hacer biosensores , y se han creado muchos animales que expresan GFP, lo que demuestra una prueba de concepto de que un gen puede expresarse en todo un organismo dado, en órganos seleccionados o en células de interés. El GFP puede introducirse en animales u otras especies a través de técnicas transgénicas y mantenerse en su genoma y en el de su descendencia. El GFP se ha expresado en muchas especies, incluyendo bacterias, levaduras, hongos, peces y mamíferos, incluyendo células humanas. Los científicos Roger Y. Tsien , Osamu Shimomura y Martin Chalfie fueron galardonados con el Premio Nobel de Química 2008 el 10 de octubre de 2008 por su descubrimiento y desarrollo de la proteína fluorescente verde.

La mayoría de los genes disponibles comercialmente para GFP y proteínas fluorescentes similares tienen una longitud aproximada de 730 pares de bases. La proteína natural tiene 238 aminoácidos. Su masa molecular es de 27 kD. [ 8 ] Por lo tanto, la fusión del gen GFP con el gen de una proteína de interés puede aumentar significativamente el tamaño y la masa molecular de la proteína, y puede afectar su función natural o cambiar su ubicación o trayectoria de transporte dentro de la célula. [ 9 ]

Fondo

Aequorea victoria
Reconstrucción 3D de una imagen confocal de progenitores neuronales con sobreexpresión de VEGF (rojo) y células progenitoras neuronales de control positivas para GFP (verde) en el bulbo olfatorio de la rata. Vasos sanguíneos positivos para RECA-1: color azul.

GFP de tipo salvaje (wtGFP)

En las décadas de 1960 y 1970, la GFP, junto con la proteína luminiscente separada aequorina (una enzima que cataliza la descomposición de la luciferina , liberando luz), fue purificada por primera vez de la medusa Aequorea victoria y sus propiedades estudiadas por Osamu Shimomura . [ 10 ] En A. victoria , la fluorescencia de la GFP ocurre cuando la aequorina interactúa con iones Ca 2+ , induciendo un brillo azul. Parte de esta energía luminiscente se transfiere a la GFP, cambiando el color general hacia el verde. [ 11 ] Sin embargo, su utilidad como herramienta para los biólogos moleculares no comenzó a darse cuenta hasta 1992 cuando Douglas Prasher informó sobre la clonación y la secuencia de nucleótidos de wtGFP en Gene . [ 12 ] La financiación para este proyecto se había agotado, por lo que Prasher envió muestras de cDNA a varios laboratorios. El laboratorio de Martin Chalfie expresó la secuencia codificante de wtGFP, con los primeros aminoácidos eliminados, en células heterólogas de E. coli y C. elegans , publicando los resultados en Science en 1994. [ 13 ] El laboratorio de Frederick Tsuji informó independientemente la expresión de la proteína recombinante un mes después. [ 14 ] Sorprendentemente, la molécula de GFP se plegó y fue fluorescente a temperatura ambiente, sin necesidad de cofactores exógenos específicos de la medusa. Aunque esta casi wtGFP era fluorescente, tenía varios inconvenientes, incluyendo espectros de excitación de doble pico, sensibilidad al pH, sensibilidad al cloruro, bajo rendimiento cuántico de fluorescencia, baja fotoestabilidad y mal plegamiento a 37 °C (99 °F) .  

La primera estructura cristalina de una GFP reportada fue la del mutante S65T, publicada por el grupo de Remington en Science en 1996. [ 15 ] Un mes después, el grupo de Phillips reportó de forma independiente la estructura de la GFP de tipo silvestre en Nature Biotechnology . [ 16 ] Estas estructuras cristalinas proporcionaron información fundamental sobre la formación del cromóforo y las interacciones entre residuos vecinos. Los investigadores han modificado estos residuos mediante mutagénesis dirigida y aleatoria para producir la amplia variedad de derivados de GFP que se utilizan desde entonces. Investigaciones posteriores sobre la GFP han demostrado que es resistente a detergentes, proteasas, tratamientos con cloruro de guanidinio (GdmCl) y cambios drásticos de temperatura. [ 17 ]

derivados de GFP

La diversidad de mutaciones genéticas queda ilustrada en esta escena de una playa de San Diego, dibujada con bacterias vivas que expresan 8 colores diferentes de proteínas fluorescentes (derivadas de GFP y dsRed).

Debido al potencial de uso generalizado y a las necesidades cambiantes de los investigadores, se han diseñado muchos mutantes diferentes de GFP. [ 18 ] [ 19 ] La primera mejora importante fue una mutación puntual (S65T) reportada en 1995 en Nature por Roger Tsien . [ 20 ] Esta mutación mejoró drásticamente las características espectrales de GFP, lo que resultó en una mayor fluorescencia, fotoestabilidad y un desplazamiento del pico de excitación principal a 488  nm, con el pico de emisión mantenido en 509  nm. Esto coincidió con las características espectrales de los conjuntos de filtros FITC  comúnmente disponibles, aumentando la practicidad de uso por parte del investigador general. Un mutante puntual de eficiencia de plegamiento a 37 °C (F64L) en este andamio, que produjo GFP mejorada (EGFP), fue descubierto en 1995 por los laboratorios de Thastrup [ 21 ] y Falkow. [ 22 ] EGFP permitió el uso práctico de GFP en células de mamíferos. EGFP tiene un coeficiente de extinción ( denotado ε) de 55 000 M⁻¹ cm⁻¹ . [ 23 ] El rendimiento cuántico de fluorescencia (QY) de EGFP es 0,60. El brillo relativo, expresado como ε•QY, es 33 000 M⁻¹ cm⁻¹ . Sin embargo, la secuencia de EGFP, ampliamente utilizada, puede producir un producto proteico no deseado, utilizando el marco +2 como plantilla. [ 24 ]

La GFP superplegable (sfGFP), una serie de mutaciones que permiten que la GFP se pliegue y madure rápidamente incluso cuando se fusiona con péptidos que se pliegan mal, se describió en 2006. [ 25 ]

Se han realizado muchas otras mutaciones, incluyendo mutantes de color; en particular, proteína fluorescente azul (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), proteína fluorescente cian (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) y derivados de proteína fluorescente amarilla (YFP, Citrine, Venus, YPet). Los derivados de BFP (excepto mKalama1) contienen la sustitución Y66H. Exhiben una banda de absorción ancha en el ultravioleta centrada cerca de 380 nanómetros y un máximo de emisión en 448 nanómetros. Se ha desarrollado un mutante de proteína fluorescente verde (BFPms1) que se une preferentemente a Zn(II) y Cu(II). BFPms1 tiene varias mutaciones importantes incluyendo el cromóforo BFP (Y66H), Y145F para un mayor rendimiento cuántico, H148G para crear un agujero en el barril beta y varias otras mutaciones que aumentan la solubilidad. La unión de Zn(II) aumenta la intensidad de fluorescencia, mientras que la unión de Cu(II) la atenúa y desplaza el máximo de absorbancia de 379 a 444  nm. Por lo tanto, pueden utilizarse como biosensores de Zn. [ 26 ]

Una gama de variantes de GFP y DsRed.

Es posible obtener más variantes de color mediante la unión del cromóforo. La mutación crítica en los derivados cian es la sustitución Y66W, que provoca que el cromóforo se forme con un componente indol en lugar de fenol. Se requieren varias mutaciones compensatorias adicionales en el barril circundante para restaurar el brillo de este cromóforo modificado debido al mayor volumen del grupo indol. En ECFP y Cerulean, la mitad N-terminal de la séptima hebra presenta dos conformaciones. Ambas conformaciones tienen un conjunto complejo de interacciones de van der Waals con el cromóforo. Las mutaciones Y145A y H148D en Cerulean estabilizan estas interacciones y permiten que el cromóforo sea más plano, esté mejor empaquetado y sea menos propenso a la extinción por colisión. [ 27 ]

La mutagénesis aleatoria dirigida al sitio adicional en combinación con el cribado basado en la vida media de fluorescencia ha estabilizado aún más la séptima hebra β dando como resultado una variante brillante, mTurquoise2, con un rendimiento cuántico (QY) de 0,93. [ 28 ] La longitud de onda desplazada al rojo de los derivados de YFP se logra mediante la mutación T203Y y se debe a las interacciones de apilamiento de electrones π entre el residuo de tirosina sustituido y el cromóforo. [ 3 ] Estas dos clases de variantes espectrales se emplean a menudo para experimentos de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET). Los reporteros FRET codificados genéticamente sensibles a moléculas de señalización celular, como calcio o glutamato, estado de fosforilación de proteínas, complementación de proteínas, dimerización de receptores y otros procesos proporcionan lecturas ópticas altamente específicas de la actividad celular en tiempo real.

La mutagénesis semirracional de varios residuos dio lugar a mutantes sensibles al pH conocidos como pHluorinas, y posteriormente a pHluorinas supereclípticas. Aprovechando el rápido cambio de pH tras la fusión de vesículas sinápticas, las pHluorinas marcadas con sinaptobrevina se han utilizado para visualizar la actividad sináptica en neuronas. [ 29 ]

La GFP sensible al estado redox ( roGFP ) se diseñó mediante la introducción de cisteínas en la estructura del barril beta. El estado redox de las cisteínas determina las propiedades fluorescentes de la roGFP . [ 30 ]

Nomenclatura

La nomenclatura de las GFP modificadas suele ser confusa debido a la superposición de varias versiones de GFP en un solo nombre. Por ejemplo, mGFP a menudo se refiere a una GFP con palmitoilación N-terminal que hace que la GFP se una a las membranas celulares . Sin embargo, el mismo término también se usa para referirse a la GFP monomérica , que a menudo se obtiene mediante la mutación A206K que rompe la interfaz del dímero. [ 31 ] La GFP de tipo silvestre tiene una débil tendencia a la dimerización a concentraciones superiores a 5  mg/mL. mGFP también significa "GFP modificada", que ha sido optimizada mediante intercambio de aminoácidos para una expresión estable en células vegetales.

En la naturaleza

Anfioxo vivo (B. floridae) bajo un microscopio de fluorescencia.
Anfioxo vivo ( B. floridae ) bajo un microscopio de fluorescencia.
En el copépodo marino Pontella mimocerami

Se desconoce la función tanto de la bioluminiscencia (primaria) (debido a la acción de la aequorina sobre la luciferina) como de la fluorescencia (secundaria) de la GFP en las medusas. La GFP se coexpresa con la aequorina en pequeños gránulos alrededor del borde de la campana de la medusa. El pico de excitación secundario (480  nm) de la GFP absorbe parte de la emisión azul de la aequorina, lo que confiere a la bioluminiscencia un tono más verdoso. El residuo de serina 65 del cromóforo de la GFP es responsable del espectro de excitación de doble pico de la GFP de tipo silvestre. Este residuo se conserva en las tres isoformas de GFP clonadas originalmente por Prasher. Casi todas las mutaciones de este residuo consolidan el espectro de excitación en un único pico a 395  nm o 480  nm. El mecanismo preciso de esta sensibilidad es complejo, pero, al parecer, implica la donación de un hidrógeno de la serina 65 al glutamato 222, lo que influye en la ionización del cromóforo. [ 3 ] Dado que una sola mutación puede aumentar drásticamente el  pico de excitación de 480 nm, haciendo que la GFP sea un socio mucho más eficiente de la aequorina, A. victoria parece preferir evolutivamente el espectro de excitación de doble pico, menos eficiente. Roger Tsien ha especulado que la variación de la presión hidrostática con la profundidad puede afectar la capacidad de la serina 65 para donar un hidrógeno al cromóforo y cambiar la proporción de los dos picos de excitación. Por lo tanto, la medusa puede cambiar el color de su bioluminiscencia con la profundidad. Sin embargo, un colapso en la población de medusas en Friday Harbor , donde se descubrió originalmente la GFP, ha obstaculizado un estudio más profundo del papel de la GFP en el entorno natural de la medusa.

Se sabe que la mayoría de las especies de anfioxos producen GFP en diversas regiones de su cuerpo. [ 32 ] A diferencia de A. victoria , los anfioxos no producen su propia luz azul, y el origen de su GFP endógena aún se desconoce. Algunos especulan que atrae el plancton hacia la boca del anfioxo, funcionando como un mecanismo de caza pasivo. También podría funcionar como un agente fotoprotector en las larvas, previniendo el daño causado por la luz azul de alta intensidad al convertirla en luz verde de menor intensidad. Sin embargo, estas teorías no han sido comprobadas.

Se han encontrado proteínas similares a la GFP en múltiples especies de copépodos marinos , particularmente de las familias Pontellidae y Aetideidae . [ 33 ] La GFP aislada de Pontella mimocerami ha mostrado altos niveles de brillo con un rendimiento cuántico de 0,92, lo que las hace casi dos veces más brillantes que la EGFP comúnmente utilizada aislada de A. victoria. [ 34 ]

Otras proteínas fluorescentes

Un estante con tubos de ensayo que muestran soluciones que brillan en diferentes colores.
Las diferentes proteínas producen diferentes colores fluorescentes cuando se exponen a la luz ultravioleta.

Existen muchas proteínas similares a la GFP que, a pesar de pertenecer a la misma familia proteica que la GFP, no se derivan directamente de Aequorea victoria . Entre ellas se incluyen dsRed , eqFP611, Dronpa , TagRFP, KFP, EosFP /IrisFP, Dendra, etc. Al haberse desarrollado a partir de proteínas de diferentes organismos, estas proteínas pueden mostrar a veces enfoques inesperados para la formación de cromóforos. Algunas de ellas, como la KFP, se desarrollan a partir de proteínas naturalmente no fluorescentes o débilmente fluorescentes para ser mejoradas significativamente mediante mutagénesis. [ 35 ] Cuando se utilizan barriles similares a la GFP con diferentes características espectrales, el espectro de excitación de un cromóforo puede utilizarse para alimentar otro cromóforo (FRET), lo que permite la conversión entre longitudes de onda de luz. [ 36 ]

Las proteínas fluorescentes que se unen al FMN (FbFP) se desarrollaron en 2007 y son una clase de proteínas fluorescentes pequeñas (11–16 kDa), independientes del oxígeno , derivadas de receptores de luz azul. Están diseñadas especialmente para su uso en condiciones anaeróbicas o hipóxicas , ya que la formación y unión del cromóforo de flavina no requiere oxígeno molecular, como ocurre con la síntesis del cromóforo de la GFP. [ 37 ]

Imagen de luz blanca, o imagen visible a simple vista, de las proteínas fluorescentes en la imagen superior.

Las proteínas fluorescentes con otros cromóforos, como la UnaG con bilirrubina , pueden presentar propiedades únicas, como una emisión desplazada hacia el rojo por encima de los 600  nm o la fotoconversión de un estado de emisión verde a un estado de emisión roja. Pueden tener longitudes de onda de excitación y emisión lo suficientemente separadas como para lograr la conversión entre luz roja y verde.

Se diseñó una nueva clase de proteína fluorescente a partir de α- aloficocianina , una ficobiliproteína que se encuentra en la cianobacteria Trichodesmium erythraeum , y se la denominó proteína fluorescente roja ultra pequeña ( smURFP ) en 2016. smURFP incorpora autocatalíticamente el cromóforo biliverdina sin necesidad de una proteína externa conocida como liasa . [ 38 ] [ 39 ] Las proteínas similares a GFP derivadas de medusas y corales requieren oxígeno y producen una cantidad estequiométrica de peróxido de hidrógeno al formarse el cromóforo. [ 40 ] smURFP no requiere oxígeno ni produce peróxido de hidrógeno. smURFP tiene un coeficiente de extinción elevado (180 000 M⁻¹ cm⁻¹ ) y un rendimiento cuántico moderado (0,20), lo que le confiere un brillo biofísico comparable al de eGFP y es aproximadamente dos veces más brillante que la mayoría de las proteínas fluorescentes rojas o rojo lejano derivadas de corales. Las propiedades espectrales de smURFP son similares a las del colorante orgánico Cy5 . [ 38 ] [ 41 ]

Colonias de E. coli que expresan proteínas fluorescentes.

En las revisiones citadas se pueden encontrar análisis sobre nuevas clases de proteínas fluorescentes y sus aplicaciones. [ 42 ] [ 43 ]

Estructura

GFP tiene una estructura de barril beta que consta de once hebras β con una disposición de lámina plegada, con una hélice alfa que contiene el cromóforo unido covalentemente 4-( p -hidroxibencilideno)imidazolidin-5-ona (HBI) que atraviesa el centro. [ 3 ] [ 15 ] [ 16 ] Cinco hélices alfa más cortas forman tapas en los extremos de la estructura. La estructura de barril beta es un cilindro casi perfecto, de 42 Å de largo y 24 Å de diámetro (algunos estudios han reportado un diámetro de 30 Å [ 17 ] ), [ 15 ] creando lo que se conoce como una formación de "lata β", que es única en la familia similar a GFP. [ 16 ] HBI, la forma modificada espontáneamente del tripéptido Ser65–Tyr66–Gly67, no es fluorescente en ausencia del andamiaje de GFP correctamente plegado y existe principalmente en la forma de fenol no ionizado en wtGFP. [ 44 ] Las cadenas laterales orientadas hacia adentro del barril inducen reacciones de ciclación específicas en Ser65–Tyr66–Gly67 que inducen la ionización de HBI a la forma fenolato y la formación del cromóforo . Este proceso de modificación postraduccional se denomina maduración . [ 45 ] La red de enlaces de hidrógeno y las interacciones de apilamiento de electrones con estas cadenas laterales influyen en el color, la intensidad y la fotoestabilidad de GFP y sus numerosos derivados. [ 46 ] La naturaleza compacta del barril excluye las moléculas de disolvente, protegiendo la fluorescencia del cromóforo de la extinción por agua. Además de la autociclación de Ser65-Tyr66-Gly67, se produce una reacción de 1,2-deshidrogenación en el residuo Tyr66. [ 17 ] Además de los tres residuos que forman el cromóforo, residuos como Gln94, Arg96, His148, Thr203 y Glu222 actúan como estabilizadores. Los residuos Gln94, Arg96 e His148 son capaces de estabilizar deslocalizando la carga del cromóforo. Arg96 es el residuo estabilizador más importante debido a que induce los realineamientos estructurales necesarios para que se produzca el anillo HBI. Cualquier mutación en el residuo Arg96 resultaría en una disminución de la velocidad de desarrollo del cromóforo porque se perderían las interacciones electrostáticas y estéricas adecuadas. Tyr66 es el receptor de enlaces de hidrógeno y no se ioniza para producir electrostática favorable. [ 47 ]

Vídeo de GFP que muestra la estructura completa y un acercamiento al cromóforo fluorescente.
Estructura de la GFP con código PDB 1EMA. Los dos residuos de tirosina que sufren mutaciones por sustitución en las posiciones 66 y 145 están resaltados en rojo. Para que esta proteína emita fluorescencia azul, estas dos tirosinas deben sustituirse por histidina y fenilalanina, respectivamente.

La proteína fluorescente azul (BFP) es la variante azul de la proteína fluorescente verde (GFP). La BFP tiene una estructura muy similar a la de la GFP. En la estructura de la BFP, dos mutaciones de sustitución en la secuencia de aminoácidos cambian su fluorescencia de verde a azul. La primera mutación ocurre dentro del cromóforo de la GFP en la posición 66, donde una tirosina se convierte en una histidina. La otra mutación en la BFP se encuentra en la tirosina en la posición 145, que se convierte en fenilalanina. La ciclación y oxidación autocatalítica de la serina, la tirosina y la glicina forman el cromóforo de la GFP. Estos tres residuos en las posiciones 65-67 conforman el cromóforo fluorescente verde. Cuando la tirosina en el cromóforo se sustituye por una histidina, cambia la estructura de plegamiento de la proteína y el espectro de emisión. La mutación T145F también se añade para aumentar la estabilidad de la proteína e intensificar la fluorescencia. Estas mutaciones son las que transforman la GFP en BFP.

Formación autocatalítica del cromóforo en wtGFP

Mecanísticamente, el proceso implica una ciclación mediada por bases seguida de deshidratación y oxidación. En la reacción de 7a a 8 se forma una enamina a partir de la imina, mientras que en la reacción de 7b a 9 se abstrae un protón. [ 48 ] El fluoróforo HBI formado se resalta en verde.

Las reacciones son catalizadas por los residuos Glu222 y Arg96. [ 48 ] [ 49 ] Un mecanismo análogo también es posible con treonina en lugar de Ser65.

Aplicaciones

Ensayos de reporteros

La proteína fluorescente verde puede utilizarse como gen reportero . [ 50 ] [ 51 ]

Por ejemplo, la GFP puede utilizarse como marcador de niveles de toxicidad ambiental. Se ha demostrado que esta proteína es una forma eficaz de medir los niveles de toxicidad de diversos productos químicos, como etanol, p - formaldehído , fenol, triclosán y parabenos. La GFP es una excelente proteína marcadora porque no afecta al huésped al introducirse en su entorno celular. Gracias a esta capacidad, no se necesitan tinciones de visualización externas, ATP ni cofactores. En cuanto a los niveles de contaminantes, se midió la fluorescencia para evaluar el efecto de estos en la célula huésped. También se midió la densidad celular. Los resultados del estudio realizado por Song, Kim y Seo (2016) mostraron una disminución tanto de la fluorescencia como de la densidad celular a medida que aumentaban los niveles de contaminantes. Esto indicaba una disminución de la actividad celular. Se requiere más investigación sobre esta aplicación específica para determinar el mecanismo por el cual la GFP actúa como marcador de contaminantes. [ 52 ] Se han observado resultados similares en el pez cebra porque los peces cebra a los que se les inyectó GFP fueron aproximadamente veinte veces más susceptibles a reconocer el estrés celular que los peces cebra a los que no se les inyectó GFP. [ 53 ]

Ventajas

La principal ventaja de la GFP es su heredabilidad, dependiendo de cómo se introdujo, lo que permite el estudio continuo de las células y tejidos en los que se expresa. La visualización de la GFP es no invasiva y solo requiere iluminación con luz azul. La GFP por sí sola no interfiere con los procesos biológicos, pero cuando se fusiona con proteínas de interés, se requiere un diseño cuidadoso de los conectores para mantener la función de la proteína de interés. Además, si se utiliza con un monómero, puede difundirse fácilmente por las células. [ 54 ]

microscopía de fluorescencia

Superresolución con dos proteínas de fusión (GFP-Snf2H y RFP-H2A), estudios de colocalización (2CLM) en el núcleo de una célula de cáncer óseo. 120.000 moléculas localizadas en un área de campo amplio (470  μm 2 ).

La disponibilidad de GFP y sus derivados ha redefinido por completo la microscopía de fluorescencia y su uso en biología celular y otras disciplinas biológicas. [ 55 ] Si bien la mayoría de las moléculas fluorescentes pequeñas, como el FITC (isotiocianato de fluoresceína), son altamente fototóxicas cuando se utilizan en células vivas, las proteínas fluorescentes como la GFP suelen ser mucho menos dañinas cuando se iluminan en células vivas. Esto ha impulsado el desarrollo de sistemas de microscopía de fluorescencia de células vivas altamente automatizados, que permiten observar células a lo largo del tiempo expresando una o más proteínas marcadas con proteínas fluorescentes.

Existen muchas técnicas para utilizar GFP en experimentos de microscopía de células vivas. La forma más directa de utilizar GFP es unirla directamente a una proteína de interés. Por ejemplo, se puede incluir GFP en un plásmido que exprese otros genes para indicar una transfección exitosa de un gen de interés. Otro método consiste en utilizar una GFP que contiene una mutación en la que la fluorescencia cambia de verde a amarillo con el tiempo, lo que se conoce como temporizador fluorescente. Con el temporizador fluorescente, los investigadores pueden estudiar el estado de producción de proteínas, como activación reciente, activación continua o desactivación reciente, según el color que indique la proteína fluorescente. [ 56 ] En otro ejemplo, los científicos han modificado la GFP para que se active solo después de la exposición a la irradiación, lo que proporciona a los investigadores una herramienta para activar selectivamente ciertas partes de una célula y observar dónde se mueven las proteínas marcadas con GFP desde su ubicación inicial. [ 57 ] Estos son solo dos ejemplos en el floreciente campo de la microscopía fluorescente; una revisión más completa de los biosensores que utilizan GFP y otras proteínas fluorescentes se puede encontrar aquí. [ 58 ]

Por ejemplo, la GFP se ha utilizado ampliamente para marcar los espermatozoides de diversos organismos con fines de identificación, como en Drosophila melanogaster , donde la expresión de GFP puede utilizarse como marcador de una característica particular. La GFP también puede expresarse en diferentes estructuras, lo que permite la distinción morfológica. En estos casos, el gen para la producción de GFP se incorpora al genoma del organismo en la región del ADN que codifica las proteínas diana y que está controlada por la misma secuencia reguladora ; es decir, la secuencia reguladora del gen ahora controla la producción de GFP, además de la(s) proteína(s) marcada(s). En las células donde se expresa el gen y se producen las proteínas marcadas, la GFP se produce simultáneamente. Por lo tanto, solo aquellas células en las que se expresa el gen marcado o se producen las proteínas diana fluorescerán al observarse bajo microscopía de fluorescencia. El análisis de estas secuencias de vídeo a intervalos de tiempo ha redefinido la comprensión de muchos procesos biológicos, como el plegamiento de proteínas, el transporte de proteínas y la dinámica del ARN, que en el pasado se habían estudiado utilizando material fijo (es decir, inerte). Los datos obtenidos también se utilizan para calibrar modelos matemáticos de sistemas intracelulares y para estimar las tasas de expresión génica. [ 59 ] De manera similar, la GFP puede utilizarse como indicador de la expresión de proteínas en sistemas heterólogos. En este caso, las proteínas de fusión que contienen GFP se introducen indirectamente, utilizando el ARN del constructo, o directamente, con la propia proteína marcada. Este método es útil para estudiar las características estructurales y funcionales de la proteína marcada a escala macromolecular o de molécula única mediante microscopía de fluorescencia.

El microscopio Vertico SMI , que utiliza la tecnología SPDM Phymod, emplea el efecto de "fotoblanqueo reversible" de colorantes fluorescentes como la GFP y sus derivados para localizarlos como moléculas individuales con una resolución óptica de 10  nm. Esto también puede realizarse mediante la colocalización de dos derivados de GFP (2CLM). [ 60 ]

Otro uso poderoso de GFP es expresar la proteína en pequeños conjuntos de células específicas. Esto permite a los investigadores detectar ópticamente tipos específicos de células in vitro (en una placa), o incluso in vivo (en el organismo vivo). [ 61 ] GFP se considera un reportero confiable de la expresión génica en células eucariotas cuando la fluorescencia se mide por citometría de flujo. [ 62 ] La combinación genética de varias variantes espectrales de GFP es un truco útil para el análisis de circuitos cerebrales ( Brainbow ). [ 63 ] Otros usos interesantes de proteínas fluorescentes en la literatura incluyen el uso de FP como sensores del potencial de membrana neuronal , [ 64 ] el seguimiento de receptores AMPA en membranas celulares, [ 65 ] la entrada viral y la infección de virus de influenza individuales y virus lentivirales, [ 66 ] [ 67 ] etc.

También se ha descubierto que las nuevas líneas de ratas transgénicas GFP pueden ser relevantes para la terapia génica y la medicina regenerativa. [ 68 ] Al utilizar GFP de "alta expresión", las ratas transgénicas muestran una alta expresión en la mayoría de los tejidos y en muchas células que no se han caracterizado o se han caracterizado de forma deficiente en ratas transgénicas GFP anteriores.

Se ha demostrado que la GFP es útil en criobiología como ensayo de viabilidad . La correlación de la viabilidad medida mediante ensayos con azul de tripano fue de 0,97. [ 69 ] Otra aplicación es el uso de la cotransfección de GFP como control interno de la eficiencia de la transfección en células de mamíferos. [ 70 ]

Un posible uso novedoso de la GFP consiste en utilizarla como un monitor sensible de procesos intracelulares mediante un sistema láser eGFP creado a partir de una línea celular de riñón embrionario humano. El primer láser vivo diseñado se crea mediante una célula que expresa eGFP dentro de una cavidad óptica reflectante, a la que se le aplican pulsos de luz azul. Al alcanzar un determinado umbral de pulso, la emisión óptica de la eGFP se vuelve más brillante y completamente uniforme en color verde puro con una longitud de onda de 516  nm. Antes de ser emitida como luz láser, la luz rebota dentro de la cavidad resonante y pasa por la célula numerosas veces. Al estudiar los cambios en la actividad óptica, los investigadores pueden comprender mejor los procesos celulares. [ 71 ] [ 72 ]

La GFP se utiliza ampliamente en la investigación del cáncer para marcar y rastrear células cancerosas. Las células cancerosas marcadas con GFP se han utilizado para modelar la metástasis, el proceso por el cual las células cancerosas se propagan a órganos distantes. [ 73 ]

GFP dividida

La GFP se puede utilizar para analizar la colocalización de proteínas. Esto se logra dividiendo la proteína en dos fragmentos que pueden autoensamblarse y luego fusionando cada uno de ellos a las dos proteínas de interés. Por sí solos, estos fragmentos incompletos de GFP no pueden fluorescer. Sin embargo, si las dos proteínas de interés se colocalizan, los dos fragmentos de GFP se ensamblan para formar una estructura similar a la GFP que sí puede fluorescer. Por lo tanto, midiendo el nivel de fluorescencia es posible determinar si las dos proteínas de interés se colocalizan. [ 74 ]

Macrofotografía

Los procesos biológicos a macroescala, como la propagación de infecciones virales, pueden seguirse utilizando el marcaje con GFP. [ 75 ] En el pasado, se ha utilizado luz ultravioleta (UV) mutagénica para iluminar organismos vivos (por ejemplo, véase [ 76 ] ) para detectar y fotografiar la expresión de GFP. Recientemente, se ha desarrollado una técnica que utiliza luces LED no mutagénicas [ 77 ] para macrofotografía. [ 78 ] La técnica utiliza un accesorio de cámara de epifluorescencia [ 79 ] basado en el mismo principio utilizado en la construcción de microscopios de epifluorescencia .

Mascotas transgénicas

Ratones que expresan GFP bajo luz ultravioleta (izquierda y derecha), en comparación con un ratón normal (centro).

Alba , una coneja verde fluorescente, fue creada por un laboratorio francés por encargo de Eduardo Kac utilizando GFP con fines artísticos y de comentario social. [ 80 ] La empresa estadounidense Yorktown Technologies comercializa a las tiendas de acuarios el pez cebra verde fluorescente ( GloFish ) que se desarrolló inicialmente para detectar la contaminación en las vías fluviales. NeonPets, una empresa con sede en EE. UU., ha comercializado ratones verdes fluorescentes para la industria de mascotas como NeonMice. [ 81 ] Los cerdos verdes fluorescentes, conocidos como Noels, fueron criados por un grupo de investigadores liderado por Wu Shinn-Chih en el Departamento de Ciencia y Tecnología Animal de la Universidad Nacional de Taiwán . [ 82 ] Un equipo japonés-estadounidense creó gatos verdes fluorescentes como prueba de concepto para utilizarlos potencialmente como organismos modelo para enfermedades, en particular el VIH . [ 83 ] En 2009, un equipo surcoreano de la Universidad Nacional de Seúl crió los primeros beagles transgénicos con células de fibroblastos de anémonas marinas. Los perros emiten una luz fluorescente roja y están diseñados para permitir a los científicos estudiar los genes que causan enfermedades humanas como la narcolepsia y la ceguera . [ 84 ]

Arte

Escultura de Julian Voss-Andreae basada en GFP, titulada "Medusa de acero" (2006). La imagen muestra la escultura de acero inoxidable en los Laboratorios Friday Harbor en la isla de San Juan (Washington, EE. UU.), lugar donde se descubrió la GFP.

Julian Voss-Andreae , artista de origen alemán especializado en "esculturas de proteínas", [ 85 ] creó esculturas basadas en la estructura de la GFP, incluyendo la "Proteína Fluorescente Verde" (2004), de 1,70 metros (5 pies 7 pulgadas) de altura ,[ 86 ] y la "Medusa de Acero" (2006) , de 1,40 metros (4 pies 7 pulgadas) de altura. Esta última escultura se encuentra en el lugar donde Shimomura descubrió la GFP en 1962, en los Laboratorios Friday Harbor de la Universidad de Washington . [ 87 ]    

Véase también

Referencias

  1. ^ Ormö M, Cubitt AB, Kallio K, Gross LA, Tsien RY, Remington SJ (septiembre de 1996). "Estructura cristalina de la proteína fluorescente verde Aequorea victoria". Ciencia . 273 (5280): 1392– 5. Bibcode : 1996Sci...273.1392O . doi : 10.1126/ciencia.273.5280.1392 . PMID 8703075 . S2CID 43030290 .  
  2. ↑ Prendergast FG, Mann KG (agosto de 1978). "Propiedades químicas y físicas de la aequorina y la proteína fluorescente verde aisladas de Aequorea forskålea". Biochemistry . 17 (17): 3448– 53. doi : 10.1021/bi00610a004 . PMID 28749 . 
  3. 1 2 3 4 Tsien RY (1998). "La proteína verde fluorescente" (PDF) . Annual Review of Biochemistry . 67 : 509–44 . doi : 10.1146/annurev.biochem.67.1.509 . PMID 9759496 . 
  4. ↑ Salih A (2019). "Proteínas fluorescentes" . En Cox G (ed.). Fundamentos de la imagen por fluorescencia . Boca Raton: Jenny Stanford Publishing. pág. 122. doi : 10.1201/9781351129404 . ISBN  978-1-351-12940-4. S2CID 213688192 . 
  5. ↑ Stepanenko OV, Verkhusha VV, Kuznetsova IM, Uversky VN, Turoverov KK (agosto de 2008). "Proteínas fluorescentes como biomarcadores y biosensores: arrojando luz de color sobre procesos moleculares y celulares" . Current Protein & Peptide Science . 9 (4): 338– 69. doi : 10.2174/138920308785132668 . PMC 2904242. PMID 18691124 .  
  6. ↑ Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC (febrero de 1994). "Proteína fluorescente verde como marcador de la expresión génica". Science . 263 (5148). Biblioteca Nacional de Medicina: 802– 805. Bibcode : 1994Sci...263..802C . doi : 10.1126/science.8303295 . PMID 8303295 . 
  7. ↑ Phillips GJ (octubre de 2001). "Proteína fluorescente verde : una idea brillante para el estudio de la localización de proteínas bacterianas". FEMS Microbiology Letters . 204 (1): 9– 18. doi : 10.1111/j.1574-6968.2001.tb10854.x . PMID 11682170 . 
  8. ↑ Uckert W, Pedersen L, Günzburg W (2000). "Vector retroviral de proteína fluorescente verde: generación de células productoras de alto título y sobrenadante viral". Terapia génica del cáncer . Métodos en medicina molecular. Vol. 35. págs. 275–85 . doi : 10.1385/1-59259-086-1:275 . ISBN   1-59259-086-1. PMID 21390811 . 
  9. ↑ Goodman SR, ed. (2008). «Capítulo 1 - Herramientas del biólogo celular: Proteína fluorescente verde». Biología celular médica (3.ª ed.). Ámsterdam: Elsevier/Academic Press. págs. 14–25 . doi : 10.1016/B978-0-12-370458-0.50006-2 . ISBN   978-0-12-370458-0. S2CID 90224559 . 
  10. ↑ Shimomura O, Johnson FH, Saiga Y (junio de 1962). "Extracción, purificación y propiedades de la aequorina, una proteína bioluminiscente de la hidromedusa luminosa Aequorea". Journal of Cellular and Comparative Physiology . 59 (3): 223–39 . doi : 10.1002/jcp.1030590302 . PMID 13911999 . 
  11. ↑ Morise H, Shimomura O, Johnson FH, Winant J (junio de 1974). "Transferencia de energía intermolecular en el sistema bioluminiscente de Aequorea". Biochemistry . 13 (12): 2656–62 . Bibcode : 1974Bioc...13.2656M . doi : 10.1021/bi00709a028 . PMID 4151620 . 
  12. ↑ Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ (febrero de 1992). "Estructura primaria de la proteína verde fluorescente de Aequorea victoria". Gene . 111 (2): 229–33 . doi : 10.1016/0378-1119(92)90691-H . PMID 1347277 . 
  13. ↑ Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC (febrero de 1994). "Proteína fluorescente verde como marcador de la expresión génica". Science . 263 ( 5148): 802– 5. Bibcode : 1994Sci...263..802C . doi : 10.1126/science.8303295 . PMID 8303295. S2CID 9043327 .  
  14. ↑ Inouye S, Tsuji FI (marzo de 1994). "Proteína fluorescente verde de Aequorea. Expresión del gen y características de fluorescencia de la proteína recombinante" . FEBS Letters . 341 ( 2–3 ): 277–80 . Bibcode : 1994FEBSL.341..277I . doi : 10.1016/0014-5793(94)80472-9 . PMID 8137953 . 
  15. ^ Ormö M, Cubitt AB, Kallio K, Gross LA, Tsien RY, Remington SJ (septiembre de 1996 ) . "Estructura cristalina de la proteína fluorescente verde Aequorea victoria". Ciencia . 273 (5280): 1392– 5. Bibcode : 1996Sci...273.1392O . doi : 10.1126/ciencia.273.5280.1392 . PMID 8703075 . S2CID 43030290 .  
  16. 1 2 3 Yang F, Moss LG, Phillips GN (octubre de 1996). "La estructura molecular de la proteína fluorescente verde" ( PDF) . Nature Biotechnology . 14 (10): 1246– 51. doi : 10.1038/nbt1096-1246 . hdl : 1911/19233 . PMID 9631087. S2CID 34713931 .  
  17. 1 2 3 Brejc K, Sixma TK, Kitts PA, Kain SR, Tsien RY, Ormö M, et al. (marzo de 1997). "Base estructural para la doble excitación y fotoisomerización de la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria " . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 94 (6): 2306– 2311. Bibcode : 1997PNAS...94.2306B . doi : 10.1073/pnas.94.6.2306 . PMC 20083. PMID 9122190 .   
  18. ↑ Shaner NC, Steinbach PA, Tsien RY (dic. 2005). "Una guía para elegir proteínas fluorescentes" ( PDF) . Nature Methods . 2 (12): 905– 9. doi : 10.1038/nmeth819 . PMID 16299475. S2CID 10024284 .  
  19. ↑ Wilhelmsson M, Tor Y (2016). Análogos fluorescentes de bloques de construcción biomoleculares: diseño y aplicaciones . Nueva Jersey: Wiley. ISBN 978-1-118-17586-6.
  20. ↑ Heim R, Cubitt AB, Tsien RY (febrero de 1995). " Fluorescencia verde mejorada" (PDF) . Nature . 373 (6516): 663–4 . Bibcode : 1995Natur.373..663H . doi : 10.1038/373663b0 . PMID 7854443. S2CID 40179694 .  
  21. ^ Patente estadounidense 6172188 , Thastrup O, Tullin S, Kongsbak Poulsen L, Bjørn S, "Fluorescent Proteins", publicado el 9 de enero de 2001 
  22. ↑ Cormack BP, Valdivia RH, Falkow S (1996). "Mutantes de la proteína verde fluorescente (GFP) optimizados para FACS" . Gene . 173 (1 Spec No): 33–38 . doi : 10.1016/0378-1119(95)00685-0 . PMID 8707053 . 
  23. ↑ McRae SR, Brown CL, Bushell GR (mayo de 2005). "Purificación rápida de EGFP, EYFP y ECFP con alto rendimiento y pureza". Protein Expression and Purification . 41 (1): 121– 127. doi : 10.1016/j.pep.2004.12.030 . PMID 15802229 . 
  24. ↑ Wang Z, Ma H, Mao Y, Ma K (2026-06-06). "La secuencia eGFP ampliamente utilizada produce un producto proteico no deseado". bioRxiv 10.64898/2026.06.02.729456 . 
  25. ↑ Pédelacq JD, Cabantous S, Tran T, Terwilliger TC, Waldo GS (enero de 2006). "Ingeniería y caracterización de una proteína fluorescente verde superplegable". Nature Biotechnology . 24 (1): 79– 88. doi : 10.1038/nbt1172 . PMID 16369541. S2CID 2966399 .  
  26. ↑ Barondeau DP, Kassmann CJ, Tainer JA, Getzoff ED (abril de 2002). "Química estructural de un biosensor de Zn de proteína fluorescente verde". Journal of the American Chemical Society . 124 (14): 3522–3524 . Bibcode : 2002JAChS.124.3522B . doi : 10.1021/ja0176954 . PMID 11929238 . 
  27. ^ Lelimousin M, Noirclerc-Savoye M, Lazareno-Saez C, Paetzold B, Le Vot S, Chazal R, et al. (octubre de 2009). "Dinámica intrínseca en ECFP y rendimiento cuántico de fluorescencia de control cerúleo". Bioquímica . 48 (42): 10038– 10046. Bibcode : 2009Bioc...4810038L . doi : 10.1021/bi901093w . PMID 19754158 .  
  28. ^ Goedhart J, von Stetten D, Noirclerc-Savoye M, Lelimousin M, Joosen L, Hink MA, et al. (2012). "Evolución guiada por la estructura de proteínas fluorescentes cian hacia un rendimiento cuántico del 93%" . Comunicaciones de la naturaleza . 3 751. Código Bib : 2012NatCo...3..751G . doi : 10.1038/ncomms1738 . PMC 3316892 . PMID 22434194 .   
  29. ↑ Miesenböck G, De Angelis DA, Rothman JE (julio de 1998). "Visualización de la secreción y la transmisión sináptica con proteínas fluorescentes verdes sensibles al pH". Nature . 394 ( 6689): 192– 5. Bibcode : 1998Natur.394..192M . doi : 10.1038/28190 . PMID 9671304. S2CID 4320849 .  
  30. ↑ Hanson GT, Aggeler R, Oglesbee D, Cannon M, Capaldi RA, Tsien RY, et al. (marzo de 2004). "Investigación del potencial redox mitocondrial con indicadores de proteína fluorescente verde sensibles al redox" . The Journal of Biological Chemistry . 279 (13): 13044– 53. Bibcode : 2004JBiCh.27913044H . doi : 10.1074/jbc.M312846200 . PMID 14722062 .  
  31. ↑ Zacharias DA, Violin JD, Newton AC, Tsien RY (mayo de 2002). "Partición de GFP monoméricas modificadas con lípidos en microdominios de membrana de células vivas". Science . 296 ( 5569): 913–16 . Bibcode : 2002Sci...296..913Z . doi : 10.1126/science.1068539 . PMID 11988576. S2CID 14957077 .  
  32. ↑ Yue JX, Holland ND, Holland LZ, Deheyn DD (junio de 2016). "La evolución de los genes que codifican las proteínas fluorescentes verdes: perspectivas de los cefalocordados (anfioxo)" . Scientific Reports . 6 (1) 28350. Bibcode : 2016NatSR...628350Y . doi : 10.1038/srep28350 . PMC 4911609. PMID 27311567 .  
  33. ↑ Hunt ME, Scherrer MP, Ferrari FD, Matz MV (julio de 2010). "Proteínas fluorescentes de color verde muy brillante del copépodo Pontellidae Pontella mimocerami" . PLOS ONE . 5 (7) e11517. Bibcode : 2010PLoSO...511517H . doi : 10.1371/journal.pone.0011517 . PMC 2904364. PMID 20644720 .  
  34. ↑ "eGFP" . FPbase .
  35. ↑ Chudakov DM, Belousov VV, Zaraisky AG, Novoselov VV, Staroverov DB, Zorov DB, et al. (febrero de 2003). "Kindling de proteínas fluorescentes para un fotoetiquetado preciso in vivo". Nature Biotechnology . 21 (2): 191– 4. doi : 10.1038/nbt778 . PMID 12524551. S2CID 52887792 .   
  36. ↑ Wiens MD, Shen Y, Li X, Salem MA, Smisdom N, Zhang W, et al. (diciembre de 2016). "Una proteína fluorescente heterodimérica verde-roja en tándem con alta eficiencia FRET". ChemBioChem . 17 ( 24): 2361– 2367. doi : 10.1002/cbic.201600492 . PMID 27781394. S2CID 4301322 .   
  37. ↑ Drepper T, Eggert T, Circolone F, Heck A, Krauss U, Guterl JK, et al. (abril de 2007). "Proteínas reporteras para fluorescencia in vivo sin oxígeno". Nature Biotechnology . 25 (4): 443– 445. Bibcode : 2007NatBi..25..443D . doi : 10.1038/ nbt1293 . PMID 17351616. S2CID 7335755 .   
  38. 1 2 Rodriguez EA, Tran GN, Gross LA, Crisp JL, Shu X, Lin JY, et al. (septiembre de 2016). "Una proteína fluorescente de color rojo lejano evolucionó a partir de una ficobiliproteína cianobacteriana" . Nature Methods . 13 (9): 763– 9. doi : 10.1038/nmeth.3935 . PMC 5007177. PMID 27479328 .   
  39. ↑ Mattson S, Tran GN, Rodriguez EA (2023). "Evolución dirigida de proteínas fluorescentes en bacterias". En Sharma M (ed.). Proteínas fluorescentes . Métodos en biología molecular. Vol. 2564. Nueva York, NY: Springer US. pp. 75–97 . doi : 10.1007/978-1-0716-2667-2_4 . ISBN   978-1-0716-2666-5. PMID 36107338 . 
  40. ↑ Tsien RY (1998-01-01). " La proteína fluorescente verde". Annual Review of Biochemistry . 67 (1): 509– 44. doi : 10.1146/annurev.biochem.67.1.509 . PMID 9759496. S2CID 8138960 .  
  41. ↑ Maiti A, Buffalo CZ, Saurabh S, Montecinos-Franjola F, Hachey JS, Conlon WJ, et al. (julio de 2023). " Caracterización estructural y fotofísica de la pequeña proteína fluorescente ultrarroja" . Nature Communications . 14 (1) 4155. Bibcode : 2023NatCo..14.4155M . doi : 10.1038/s41467-023-39776-9 . PMC 10338489. PMID 37438348 .   
  42. ↑ Rodriguez EA, Campbell RE, Lin JY, Lin MZ, Miyawaki A, Palmer AE, et al. (febrero de 2017). " La creciente y brillante caja de herramientas de proteínas fluorescentes y fotoactivas" . Trends in Biochemical Sciences . 42 (2): 111– 129. doi : 10.1016/j.tibs.2016.09.010 . PMC 5272834. PMID 27814948 .   
  43. ↑ Montecinos-Franjola F, Lin JY, Rodriguez EA (16 de noviembre de 2020). "Proteínas fluorescentes para imágenes in vivo, ¿dónde está la biliverdina?". Biochemical Society Transactions . 48 (6): 2657– 2667. doi : 10.1042/BST20200444 . PMID 33196077. S2CID 226971864 .  
  44. ↑ Bokman SH, Ward WW (1982). "Desnaturalización reversible de la proteína verde fluorescente de Aequorea: separación física y caracterización de la proteína renaturalizada". Biochemistry . 21 (19): 4535– 4540. doi : 10.1021/bi00262a003 . PMID 6128025 . 
  45. ↑ Pouwels LJ, Zhang L, Chan NH, Dorrestein PC, Wachter RM (septiembre de 2008). "Estudios del efecto isotópico cinético sobre la tasa de novo de formación de cromóforos en variantes de GFP de maduración rápida y lenta" . Biochemistry . 47 ( 38): 10111–22 . doi : 10.1021/bi8007164 . PMC 2643082. PMID 18759496 .  
  46. ↑ Chudakov DM, Matz MV, Lukyanov S, Lukyanov KA (julio de 2010). "Proteínas fluorescentes y sus aplicaciones en la obtención de imágenes de células y tejidos vivos". Physiological Reviews . 90 (3): 1103– 63. doi : 10.1152/physrev.00038.2009 . PMID 20664080. S2CID 10767597 .  
  47. ↑ Stepanenko OV, Verkhusha VV, Shavlovsky MM, Kuznetsova IM, Uversky VN, Turoverov KK (noviembre de 2008). "Comprensión del papel de Arg96 en la estructura y estabilidad de la proteína fluorescente verde" . Proteins . 73 ( 3): 539– 551. doi : 10.1002/prot.22089 . PMC 2908022. PMID 18470931 .  
  48. 1 2 Rosenow MA, Huffman HA, Phail ME, Wachter RM (abril de 2004). "La estructura cristalina de la variante Y66L de la proteína fluorescente verde respalda un mecanismo de ciclación-oxidación-deshidratación para la maduración del cromóforo". Biochemistry . 43 (15): 4464– 4472. doi : 10.1021/bi0361315 . PMID 15078092 . 
  49. ↑ Ma Y, Yu JG, Sun Q, Li Z, Smith SC (2015-07-01). "El mecanismo de deshidratación en la maduración del cromóforo de la proteína fluorescente verde de tipo salvaje: un estudio teórico". Chemical Physics Letters . 631–632 : 42–46 . Bibcode : 2015CPL...631...42M . doi : 10.1016/j.cplett.2015.04.061 . ISSN 0009-2614 . 
  50. ↑ Jugder BE, Welch J, Braidy N, Marquis CP (26 de julio de 2016). "Construcción y uso de una fusión del promotor de hidrogenasa soluble (PSH) de Cupriavidus necator H16 con gfp (proteína fluorescente verde)" . PeerJ . 4e2269 . Bibcode : 2016PeerJ ...4e2269J . doi : 10.7717/peerj.2269 . PMC 4974937. PMID 27547572 .  
  51. ↑ Arun KH, Kaul CL, Ramarao P (2005). "Proteínas fluorescentes verdes en la investigación de receptores: una herramienta emergente para el descubrimiento de fármacos". Journal of Pharmacological and Toxicological Methods . 51 (1): 1– 23. doi : 10.1016/j.vascn.2004.07.006 . PMID 15596111 . 
  52. ↑ Song YH, Kim CS, Seo JH (abril de 2016). "Monitoreo no invasivo de la toxicidad ambiental a través de Escherichia coli que expresa proteína fluorescente verde". Korean Journal of Chemical Engineering . 33 (4): 1331– 6. doi : 10.1007/s11814-015-0253-1 . S2CID 62828580 . 
  53. ↑ Pan Y, Leifert A, Graf M, Schiefer F, Thoröe-Boveleth S, Broda J, et al. (marzo de 2013). "Análisis en tiempo real de alta sensibilidad de la toxicidad de nanopartículas en peces cebra que expresan proteína fluorescente verde". Small . 9 (6). Weinheim an Der Bergstrasse, Alemania: 863–9 . doi : 10.1002/smll.201201173 . PMID 23143852 .  
  54. ↑ Chalfie M (junio de 2009). "GFP: Iluminando la vida" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 106 (25): 10073–10080 . Bibcode : 2009PNAS..10610073C . doi : 10.1073 / pnas.0904061106 . PMC 2700921. PMID 19553219 .  
  55. ↑ Yuste R (dic. 2005). "Microscopía de fluorescencia en la actualidad". Nature Methods . 2 (12): 902– 4. Bibcode : 2005NaMet...2..902Y . doi : 10.1038/nmeth1205-902 . PMID 16299474. S2CID 205418407 .  
  56. ^ Terskikh A, Fradkov A, Ermakova G, Zaraisky A, Tan P, Kajava AV y otros. (Noviembre de 2000). " "Temporizador fluorescente": proteína que cambia de color con el tiempo". Science . 290 (5496): 1585–8 . Bibcode : 2000Sci...290.1585T . doi : 10.1126/science.290.5496.1585 . PMID 11090358 . 
  57. ↑ Patterson GH, Lippincott-Schwartz J (septiembre de 2002). "Una GFP fotoactivable para el fotomarcaje selectivo de proteínas y células". Science . 297 ( 5588): 1873– 7. Bibcode : 2002Sci...297.1873P . doi : 10.1126/science.1074952 . PMID 12228718. S2CID 45058411 .  
  58. ↑ Lin W, Mehta S, Zhang J (octubre de 2019). "Los biosensores fluorescentes codificados genéticamente iluminan la señalización de la quinasa en el cáncer" . The Journal of Biological Chemistry . 294 (40): 14814– 14822. doi : 10.1074/jbc.REV119.006177 . PMC 6779441. PMID 31434714 .  
  59. ↑ Komorowski M, Finkenstädt B, Rand D (junio de 2010). "Uso de un único gen reportero fluorescente para inferir la vida media del ruido extrínseco y otros parámetros de la expresión génica" . Biophysical Journal . 98 (12): 2759–2769 . Bibcode : 2010BpJ....98.2759K . doi : 10.1016 / j.bpj.2010.03.032 . PMC 2884236. PMID 20550887 .  
  60. ↑ Gunkel M, Erdel F, Rippe K, Lemmer P, Kaufmann R, Hörmann C, et al. (junio de 2009). "Microscopía de localización de doble color de nanoestructuras celulares" . Biotechnology Journal . 4 (6): 927–38 . doi : 10.1002/biot.200900005 . PMID 19548231. S2CID 18162278 .   
  61. ↑ Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA (dic. 2005). "Proteínas fluorescentes como herramienta para imágenes in vivo". Trends in Biotechnology . 23 (12): 605– 13. doi : 10.1016/j.tibtech.2005.10.005 . PMID 16269193 . 
  62. ↑ Soboleski MR, Oaks J, Halford WP (marzo de 2005). "La proteína fluorescente verde es un reportero cuantitativo de la expresión génica en células eucariotas individuales" . FASEB Journal . 19 (3): 440– 442. doi : 10.1096/fj.04-3180fje . PMC 1242169. PMID 15640280 .  
  63. ↑ Livet J, Weissman TA, Kang H, Draft RW, Lu J, Bennis RA, et al. (Nov 2007). "Estrategias transgénicas para la expresión combinatoria de proteínas fluorescentes en el sistema nervioso". Nature . 450 (7166): 56– 62. Bibcode : 2007Natur.450...56L . doi : 10.1038/nature06293 . PMID 17972876 . S2CID 4402093 .   
  64. ↑ Baker BJ, Mutoh H, Dimitrov D, Akemann W, Perron A, Iwamoto Y, et al. (agosto de 2008). " Sensores fluorescentes codificados genéticamente del potencial de membrana" . Brain Cell Biology . 36 ( 1–4 ): 53–67 . doi : 10.1007/s11068-008-9026-7 . PMC 2775812. PMID 18679801 .   
  65. ↑ Adesnik H, Nicoll RA, England PM (dic. 2005). "La fotoinactivación de los receptores AMPA nativos revela su tráfico en tiempo real" . Neuron . 48 (6): 977–85 . doi : 10.1016/j.neuron.2005.11.030 . PMID 16364901 . 
  66. ↑ Lakadamyali M, Rust MJ, Babcock HP, Zhuang X (agosto de 2003). "Visualización de la infección de virus de influenza individuales" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 100 (16): 9280– 5. Bibcode : 2003PNAS..100.9280L . doi : 10.1073/pnas.0832269100 . PMC 170909. PMID 12883000 .  
  67. ↑ Joo KI, Wang P (octubre de 2008). "Visualización de la transducción dirigida mediante vectores lentivirales modificados" . Gene Therapy . 15 (20): 1384–96 . doi : 10.1038/gt.2008.87 . PMC 2575058. PMID 18480844 .  
  68. ↑ Remy S, Tesson L, Usal C, Menoret S, Bonnamain V, Nerriere-Daguin V, et al. (octubre de 2010). "Nuevas líneas de ratas transgénicas GFP relevantes para la medicina regenerativa y la terapia génica". Transgenic Research . 19 (5): 745– 63. doi : 10.1007/s11248-009-9352-2 . PMID 20094912. S2CID 42499768 .   
  69. ↑ Elliott G, McGrath J, Crockett-Torabi E (junio de 2000). "Proteína fluorescente verde: un nuevo ensayo de viabilidad para aplicaciones criobiológicas". Cryobiology . 40 (4): 360– 369. doi : 10.1006/cryo.2000.2258 . PMID 10924267 . 
  70. ↑ Fakhrudin N, Ladurner A, Atanasov AG, Heiss EH, Baumgartner L, Markt P, et al. (Abr 2010). "Descubrimiento, validación y caracterización mecanicista asistida por computadora de nuevos activadores neolignanos del receptor gamma activado por proliferadores de peroxisomas" . Farmacología molecular . 77 (4): 559– 66. doi : 10.1124/mol.109.062141 . PMC 3523390. PMID 20064974 .   
  71. ↑ Gather MC, Yun SH (2011). "Láseres biológicos de células individuales". Nature Photonics . 5 (7): 406– 410. Bibcode : 2011NaPho...5..406G . doi : 10.1038/nphoton.2011.99 . S2CID 54971962 . 
  72. ↑ Matson J (2011). "La proteína fluorescente verde crea láseres vivos" . Scientific American . Recuperado el 13 de junio de 2011 .
  73. ↑ Kouros-Mehr H, Bechis SK, Slorach EM, Littlepage LE, Egeblad M, Ewald AJ, et al. (febrero de 2008). "GATA-3 vincula la diferenciación tumoral y la diseminación en un modelo de cáncer de mama luminal" . Cancer Cell . 13 (2): 141– 52. doi : 10.1016/j.ccr.2008.01.011 . PMC 2262951. PMID 18242514 .   
  74. ↑ Cabantous S, Terwilliger TC, Waldo GS (enero de 2005). "Etiquetado y detección de proteínas con fragmentos autoensamblables de proteína fluorescente verde modificados". Nature Biotechnology . 23 (1): 102– 7. Bibcode : 2005NatBi..23..102C . doi : 10.1038/nbt1044 . PMID 15580262. S2CID 25833063 .  
  75. ↑ Rodman MK, Yadav NS, Artus NN (septiembre de 2002). "La progresión del silenciamiento de transgenes inducido por geminivirus está asociada con la metilación del transgén". The New Phytologist . 155 (3): 461– 468. Bibcode : 2002NewPh.155..461R . doi : 10.1046/j.1469-8137.2002.00467.x . PMID 33873315 . 
  76. ↑ Zhu YJ, Agbayani R, Moore PH (abril de 2004). "Proteína fluorescente verde como marcador de selección visual para la transformación de papaya (Carica papaya L.)". Plant Cell Reports . 22 (9): 660–7 . Bibcode : 2004PCelR..22..660M . doi : 10.1007/s00299-004-0755-5 . PMID 14749892. S2CID 23198182 .  
  77. ↑ Niwa Y, Hirano T, Yoshimoto K, Shimizu M, Kobayashi H (1999). "Detección cuantitativa no invasiva y aplicaciones de la proteína fluorescente verde no tóxica de tipo S65T en plantas vivas" . The Plant Journal . 18 (4): 455– 63. Bibcode : 1999PlJ....18..455N . doi : 10.1046/ j.1365-313X.1999.00464.x . PMID 10406127. S2CID 292648 .  
  78. ↑ Baker SS, Vidican CB, Cameron DS, Greib HG, Jarocki CC, Setaputri AW, et al. (2012-01-01). "Un accesorio epifluorescente mejora la fotografía digital de plantas completas de Arabidopsis thaliana que expresa proteína fluorescente verde con desplazamiento al rojo" . AoB Plants . 2012 pls003. doi : 10.1093/aobpla/pls003 . PMC 3296078. PMID 22479674 .   
  79. ↑ "PlantEdDL - Uso de cámaras digitales SRL en investigaciones cuantitativas de plantas que expresan proteína verde fluorescente (GFP)" . planted.botany.org . Consultado el 23 de marzo de 2016 .
  80. ↑ Kac E. "GFP Bunny" .
  81. ↑ "Ratones neón que brillan en la oscuridad" . Archivado del original el 14 de febrero de 2009. Consultado el 30 de agosto de 2016 .
  82. ↑ Científicos en Taiwán crían cerdos de color verde fluorescente
  83. ^ Wongsrikeao P, Saenz D, Rinkoski T, Otoi T, Poeschla E (2011). "Transgénesis del factor de restricción antiviral en el gato doméstico" . Métodos de la naturaleza . 8 (10): 853– 9. doi : 10.1038/nmeth.1703 . PMC 4006694 . PMID 21909101 .  
  84. ↑ Callaway E (23 de abril de 2009). "Un cachorro fluorescente es el primer perro transgénico del mundo" . New Scientist .
  85. ↑ Voss-Andreae J (2005). "Esculturas de proteínas: los bloques de construcción de la vida inspiran el arte". Leonardo . 38 : 41–45 . doi : 10.1162/leon.2005.38.1.41 . S2CID 57558522 . 
  86. ↑ Pawlak A (2005). "Proteína inspiradora" . Revista física . 4 : 12.
  87. ↑ "Escultura de Julian Voss-Andreae" . Consultado el 14 de junio de 2007 .

Lecturas adicionales

  • Pieribone V, Gruber D (2006). Brillando en la oscuridad: La ciencia revolucionaria de la biofluorescencia . Cambridge: Belknap Press. ISBN 978-0-674-01921-8OCLC 60321612​​ Libro de divulgación científica que describe la historia y el descubrimiento de la GFP.
  • Zimmer M (2005). Genes brillantes: Una revolución en biotecnología . Buffalo, NY: Prometheus Books. ISBN 978-1-59102-253-4OCLC 56614624​​ 
  • Un artículo completo sobre proteínas fluorescentes en Scholarpedia.
  • Breve resumen de los artículos más importantes sobre GFP.
  • Applet interactivo de Java que demuestra la química que hay detrás de la formación del cromóforo GFP.
  • Vídeo de la conferencia de Roger Tsien al recibir el Premio Nobel en 2008 sobre proteínas fluorescentes.
  • Espectros de excitación y emisión de diversas proteínas fluorescentes
  • Número especial de la revista Chem Soc Rev dedicado a los ganadores del Premio Nobel de Química de 2008, los profesores Osamu Shimomura , Martin Chalfie y Roger Y. Tsien.
  • Molécula del mes, junio de 2003 : una descripción general ilustrada de la GFP por David Goodsell.
  • Molécula del mes, junio de 2014 : una descripción general ilustrada de las variantes similares a la GFP por David Goodsell.
  • Proteína fluorescente verde en FPbase, una base de datos de proteínas fluorescentes.
  • Resumen de toda la información estructural disponible en el PDB para UniProt : P42212 (proteína fluorescente verde) en el PDBe-KB .