extravasación de leucocitos

Tras el reconocimiento y la activación por patógenos , los macrófagos residentes en el tejido afectado liberan citocinas como IL-1 , TNFα y quimiocinas . IL-1, TNFα y C5a ^{[ 1 ]} provocan que las células endoteliales de los vasos sanguíneos cercanos al sitio de infección expresen moléculas de adhesión celular , incluidas las selectinas . Los leucocitos circulantes se localizan hacia el sitio de la lesión o infección debido a la presencia de quimiocinas.

Al igual que el velcro, los ligandos de carbohidratos en los leucocitos circulantes se unen a las moléculas de selectina en la pared interna del vaso, con una afinidad marginal . Esto provoca que los leucocitos disminuyan su velocidad y comiencen a rodar a lo largo de la superficie interna de la pared del vaso. Durante este movimiento de rodadura, se forman y se rompen enlaces transitorios entre las selectinas y sus ligandos .

Por ejemplo, el ligando de carbohidratos para la P-selectina, el ligando de glicoproteína P-selectina-1 (PSGL-1), es expresado por diferentes tipos de leucocitos (glóbulos blancos). La unión de PSGL-1 en el leucocito a la P-selectina en la célula endotelial permite que el leucocito ruede a lo largo de la superficie endotelial. Esta interacción puede ser modulada por el patrón de glicosilación de PSGL-1, de modo que ciertas glicovariantes de PSGL-1 tendrán afinidades únicas por diferentes selectinas, lo que permite en algunos casos que las células migren a sitios específicos dentro del cuerpo (por ejemplo, la piel). ^{[ 2 ]}

Al mismo tiempo, las quimiocinas liberadas por los macrófagos activan los leucocitos rodantes y provocan que las moléculas de integrina de la superficie pasen de un estado de baja afinidad a uno de alta afinidad. Esto se ve facilitado por la activación yuxtacrina de las integrinas mediante quimiocinas y factores solubles liberados por las células endoteliales. En el estado activado, las integrinas se unen firmemente a los receptores complementarios expresados ​​en las células endoteliales, con alta afinidad. Esto provoca la inmovilización de los leucocitos, la cual varía en los vasos sanguíneos sometidos a diferentes fuerzas de cizallamiento del flujo sanguíneo.

Los citoesqueletos de los leucocitos se reorganizan de tal manera que los leucocitos se extienden sobre las células endoteliales. En esta forma, los leucocitos extienden pseudópodos y pasan a través de los espacios entre las células endoteliales. Este paso de células a través de la pared intacta del vaso se llama diapédesis . ^{[ 3 ]} Estos espacios pueden formarse a través de interacciones de los leucocitos con el endotelio, pero también de forma autónoma a través de la mecánica endotelial. ^{[ 4 ]} La transmigración del leucocito ocurre cuando las proteínas PECAM , que se encuentran en las superficies del leucocito y de la célula endotelial, interactúan y efectivamente tiran de la célula a través del endotelio. Una vez que atraviesa el endotelio, el leucocito debe penetrar la membrana basal . El mecanismo de penetración es controvertido, pero puede implicar la digestión proteolítica de la membrana, la fuerza mecánica o ambas. ^{[ 5 ]} Todo el proceso de escape del vaso sanguíneo se conoce como diapédesis . Una vez en el líquido intersticial , los leucocitos migran siguiendo un gradiente quimiotáctico hacia el lugar de la lesión o infección.

Las fases de la extravasación de leucocitos representadas en el esquema son: aproximación, captura, rodamiento, activación, unión, fortalecimiento de la unión y propagación, reptación intravascular, migración paracelular o migración transcelular.

Las selectinas se expresan poco después de la activación de las células endoteliales por citocinas a través de los macrófagos tisulares. Las células endoteliales activadas expresan inicialmente moléculas de selectina P, pero dentro de las dos horas posteriores a la activación se favorece la expresión de selectina E. Las selectinas endoteliales se unen a carbohidratos en las glicoproteínas transmembrana de los leucocitos , incluyendo la sialil-Lewis ^X.

• Selectinas P : La selectina P se expresa en células endoteliales y plaquetas activadas . Su síntesis puede ser inducida por trombina , leucotrieno B4,fragmento C5a del complemento , histamina , TNFα o LPS . Estas citocinas inducen la externalización de los cuerpos de Weibel-Palade en las células endoteliales, presentando selectinas P preformadas en la superficie celular. Las selectinas P se unen a PSGL-1 como ligando. ^{[ 6 ]}
• E-selectinas : La E-selectina se expresa en las células endoteliales activadas. La síntesis de E-selectina se produce poco después de la síntesis de P-selectina, inducida por citocinas como la IL-1 y el TNFα. Las E-selectinas se unen a PSGL-1 y ESL-1 .
• Selectinas L : Las selectinas L se expresan constitutivamente en algunos leucocitos y se sabe que se unen a GlyCAM-1 , MadCAM-1 y CD34 como ligandos.

La expresión reducida de algunas selectinas provoca una respuesta inmunitaria más lenta. Si no se produce L-selectina, la respuesta inmunitaria puede ser diez veces más lenta, ya que las P-selectinas (que también pueden ser producidas por los leucocitos) se unen entre sí. Las P-selectinas pueden unirse con alta afinidad, pero esto ocurre con menos frecuencia debido a que la densidad de sitios receptores es menor que en el caso de las moléculas más pequeñas de E-selectina. Esto aumenta la velocidad inicial de rodamiento de los leucocitos, prolongando la fase de rodamiento lento.

Las integrinas implicadas en la adhesión celular se expresan principalmente en los leucocitos. Las integrinas β2 presentes en los leucocitos rodantes se unen a las moléculas de adhesión celular endotelial , deteniendo el movimiento celular.

• LFA-1 se encuentra en los leucocitos circulantes y se une a ICAM-1 e ICAM-2 en las células endoteliales.
• Mac-1 se encuentra en los leucocitos circulantes y se une a ICAM-1 en las células endoteliales.
• VLA-4 se encuentra en leucocitos y células endoteliales, y facilita la quimiotaxis; también se une a VCAM-1.

La activación celular mediante quimiocinas extracelulares provoca la liberación de integrinas β2 preformadas desde las reservas celulares. Las moléculas de integrina migran a la superficie celular y se agrupan en zonas de alta afinidad . Los dominios intracelulares de la integrina se asocian al citoesqueleto de los leucocitos mediante la mediación de factores citosólicos como la talina , la α-actinina y la vinculina . Esta asociación induce un cambio conformacional en la estructura terciaria de la integrina , permitiendo el acceso del ligando al sitio de unión. Los cationes divalentes (por ejemplo, ^Mg²⁺ ) también son necesarios para la unión integrina-ligando.

Los ligandos de integrina ICAM-1 y VCAM-1 se activan por citocinas inflamatorias, mientras que ICAM-2 se expresa constitutivamente en algunas células endoteliales, pero su expresión disminuye por la acción de dichas citocinas. ICAM-1 e ICAM-2 comparten dos dominios N-terminales homólogos ; ambos pueden unirse a LFA-1.

Durante la quimiotaxis, el movimiento celular se ve facilitado por la unión de las integrinas β1 a componentes de la matriz extracelular : VLA-3, VLA-4 y VLA-5 a la fibronectina y VLA-2 y VLA-3 al colágeno y otros componentes de la matriz extracelular.

La extravasación está regulada por el entorno de citocinas generado por la respuesta inflamatoria y es independiente de antígenos celulares específicos . Las citocinas liberadas en la respuesta inmunitaria inicial inducen vasodilatación y disminuyen la carga eléctrica en la superficie del vaso. El flujo sanguíneo se ralentiza, lo que facilita la unión intermolecular.

• La IL-1 activa los linfocitos residentes y el endotelio vascular.
• El TNFα aumenta la permeabilidad vascular y activa el endotelio vascular.
• CXCL8 (IL-8) forma un gradiente quimiotáctico que dirige a los leucocitos hacia el sitio de lesión/infección tisular ( CCL2 tiene una función similar a CXCL8, induciendo la extravasación de monocitos y su desarrollo en macrófagos); también activa las integrinas de los leucocitos.

En 1976, las imágenes SEM mostraron que había receptores de localización en puntas similares a microvellosidades en los leucocitos que permitirían a los glóbulos blancos salir del vaso sanguíneo y entrar en el tejido. ^{[ 7 ]} Desde la década de 1990, se ha estudiado intensamente la identidad de los ligandos involucrados en la extravasación de leucocitos. Este tema finalmente pudo estudiarse a fondo bajo condiciones de esfuerzo cortante fisiológico utilizando una cámara de flujo típica. ^{[ 8 ]} Desde los primeros experimentos, se observó un fenómeno extraño. Se observó que las interacciones de unión entre los glóbulos blancos y las paredes del vaso se volvían más fuertes bajo una fuerza mayor. Se descubrió que las selectinas (E-selectina, L-selectina y P-selectina) estaban involucradas en este fenómeno. El requisito del umbral de corte parece contraintuitivo porque aumentar el corte eleva la fuerza aplicada a los enlaces adhesivos y parecería que esto debería aumentar la capacidad de desalojo. Sin embargo, las células ruedan más lentamente y de manera más regular hasta que se alcanza un corte óptimo donde la velocidad de rodadura es mínima. Este fenómeno paradójico no ha sido explicado satisfactoriamente a pesar del gran interés que ha despertado.

Una hipótesis inicialmente descartada que ha estado ganando interés es la hipótesis del enlace de captura, donde el aumento de la fuerza sobre la célula ralentiza las tasas de disociación y prolonga la vida útil del enlace y estabiliza el paso de rodadura de la extravasación de leucocitos. ^{[ 9 ]} La adhesión celular mejorada por el flujo sigue siendo un fenómeno inexplicado que podría resultar de un aumento dependiente del transporte en las tasas de asociación o una disminución dependiente de la fuerza en las tasas de disociación de los enlaces adhesivos. La L-selectina requiere un mínimo particular de cizallamiento para mantener la rodadura de leucocitos sobre el ligando de glicoproteína P-selectina-1 (PSGL-1) y otros ligandos vasculares. Se ha hipotetizado que las fuerzas bajas disminuyen las tasas de disociación de L-selectina-PSGL-1 (enlaces de captura), mientras que las fuerzas más altas aumentan las tasas de disociación (enlaces de deslizamiento). Los experimentos han encontrado que una disminución dependiente de la fuerza en las tasas de disociación dictaba la rodadura mejorada por el flujo de microesferas portadoras de L-selectina o neutrófilos sobre PSGL-1. ^[5] Los enlaces de captura permiten que el aumento de la fuerza convierta los tiempos de vida de los enlaces cortos en tiempos de vida de los enlaces largos, lo que disminuye las velocidades de rodadura y aumenta la regularidad de los pasos de rodadura a medida que el cizallamiento aumenta desde el umbral hasta un valor óptimo. A medida que aumenta el cizallamiento, las transiciones a enlaces de deslizamiento acortan sus tiempos de vida de enlace y aumentan las velocidades de rodadura y disminuyen la regularidad de rodadura. Se hipotetiza que las alteraciones dependientes de la fuerza de los tiempos de vida de los enlaces gobiernan la adhesión celular dependiente de L-selectina por debajo y por encima del óptimo de cizallamiento. Estos hallazgos establecen una función biológica para los enlaces de captura como un mecanismo para la adhesión celular mejorada por el flujo. ^{[ 10 ]} Mientras que los leucocitos parecen experimentar un comportamiento de enlace de captura con el aumento del flujo que conduce a los pasos de anclaje y rodadura en la extravasación de leucocitos, la adhesión firme se logra a través de otro mecanismo, la activación de integrinas.

Otros ejemplos biológicos de un mecanismo de unión por captura se observan en bacterias que se adhieren firmemente a las paredes del tracto urinario en respuesta a altas velocidades de fluidos y grandes fuerzas de cizallamiento ejercidas sobre las células y bacterias con puntas adhesivas de fimbrias. ^{[ 9 ] [ 11 ]} Los mecanismos esquemáticos propuestos sobre cómo el aumento de la fuerza de cizallamiento provoca interacciones de unión más fuertes entre bacterias y células diana muestran que la unión por captura actúa de forma muy similar a una trampa china para dedos. En una unión por captura, la fuerza sobre la célula tira de la punta adhesiva de una fimbria para que se cierre más firmemente sobre su célula diana. A medida que aumenta la fuerza, más fuerte es la unión entre la fimbria y el receptor celular en la superficie de la célula diana. ^{[ 11 ]} En una unión críptica, la fuerza hace que la fimbria gire hacia la célula diana y tenga más sitios de unión capaces de unirse a los ligandos de la célula diana, principalmente moléculas de azúcar. Esto crea una interacción de unión más fuerte entre la bacteria y la célula diana.

Las cámaras de flujo de placas paralelas se encuentran entre las cámaras de flujo más populares utilizadas para estudiar la interacción leucocito-endotelio in vitro. Se han utilizado para la investigación desde finales de la década de 1980. ^{[ 12 ]} Aunque las cámaras de flujo han sido una herramienta importante para estudiar el rodamiento de leucocitos, existen varias limitaciones cuando se trata de estudiar las condiciones fisiológicas in vivo, ya que carecen de correspondencia con la geometría in vivo, incluyendo la escala/relación de aspecto (microvasculatura vs modelos de vasos grandes), condiciones de flujo (por ejemplo, flujos convergentes vs divergentes en bifurcaciones) y requieren grandes volúmenes de reactivos (~ ml) debido a su gran tamaño (altura > 250  μm y ancho > 1 mm). ^{[ 13 ]} Con la llegada de los dispositivos basados ​​en microfluídica, estas limitaciones se han superado. Un nuevo modelo in vitro, llamado SynVivo Synthetic microvascular network (SMN), fue producido por CFD Research Corporation (CFDRC) y desarrollado utilizando el proceso de litografía blanda basado en polidimetilsiloxano (PDMS). El SMN puede recrear la compleja vasculatura in vivo, incluyendo características geométricas, condiciones de flujo y volúmenes de reactivos, proporcionando así un entorno biológicamente realista para estudiar el comportamiento celular de la extravasación, pero también para la administración y el descubrimiento de fármacos. ^{[ 14 ] [ 15 ]}