ARN antisentido

El ARN antisentido ( asRNA ), también conocido como transcrito antisentido, ^{[ 1 ]} transcrito antisentido natural (NAT) ^{[ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]} u oligonucleótido antisentido , ^{[ 5 ]} es un ARN monocatenario complementario a un ARN mensajero (ARNm) codificante de proteínas con el que se hibrida, bloqueando así su traducción a proteína . Los asRNA (que se producen de forma natural) se han encontrado tanto en procariotas como en eucariotas , ^{[ 1 ]} y se pueden clasificar en ARN no codificantes (ARNnc) cortos (<200 nucleótidos) y largos (>200 nucleótidos) . ^{[ 4 ]} La función principal del asRNA es regular la expresión génica . Los asRNA también se pueden producir sintéticamente y se utilizan ampliamente como herramientas de investigación para la inactivación génica . También pueden tener aplicaciones terapéuticas. ^{[ 6 ] [ 1 ] [ 4 ]}

Algunos de los primeros ARN antisentido (asRNA) se descubrieron durante la investigación de proteínas funcionales. Un ejemplo fue el asRNA micF . Al caracterizar la porina de membrana externa ompC en E. coli , algunos de los clones del promotor ompC observados fueron capaces de reprimir la expresión de otras porinas de membrana, como ompF. Se descubrió que la región responsable de esta función de represión era un locus de 300 pares de bases corriente arriba del promotor ompC. Esta región de 300 pares de bases muestra un 70 % de identidad de secuencia con el extremo 5' del ARNm de ompF, por lo que el transcrito de este locus de 300 pares de bases era complementario al ARNm de ompF. Posteriormente, se descubrió que este transcrito, denominado micF, era un asRNA de ompF y capaz de regular negativamente la expresión de ompF bajo estrés mediante la formación de un dúplex con el ARNm de ompF. Esto induce la degradación del ARNm de ompF. ^{[ 2 ]}

A diferencia del ARN micF, que se descubrió por accidente, la mayoría de los ARN antisentido (asRNA) se descubrieron mediante búsquedas genómicas de ARN reguladores pequeños y análisis del transcriptoma . Convencionalmente, el primer paso implica predicciones computacionales basadas en algunas características conocidas de los asRNA. Durante las búsquedas computacionales, se excluyen las regiones codificantes. Se priorizan las regiones que se predice que tienen estructuras de ARN conservadas y actúan como promotores huérfanos y terminadores independientes de Rho durante el análisis. Dado que las búsquedas computacionales se centran en la región intergénica , es probable que los asRNA que se transcriben desde la hebra opuesta de un gen codificante no se detecten con este método. Para detectar asRNA transcritos desde la región codificante, se pueden utilizar microarrays de oligonucleótidos . En este método, se pueden usar una o ambas hebras de los genes codificantes como sondas. Además de las búsquedas computacionales y los microarrays, algunos asRNA se descubrieron mediante la secuenciación de clones de ADNc y el mapeo de elementos promotores. ^{[ 7 ]} Aunque muchos hallazgos de los enfoques mencionados anteriormente dieron lugar a una gran cantidad de posibles ARN antisentido, solo unos pocos fueron probados como ARN antisentido reales mediante pruebas funcionales adicionales. Para minimizar el número de resultados falsos positivos, los nuevos enfoques de los últimos años se han centrado en la transcripción específica de la cadena, los ARN no codificantes de unión a la cromatina y los estudios de células individuales. ^{[ 1 ]}

La idea de utilizar ARN antisentido (asRNA) como dianas farmacológicas surgió en 1978, cuando Zamecnik y Stephenson descubrieron un oligonucleótido antisentido dirigido al ARN viral del virus del sarcoma de Rous, capaz de inhibir la replicación viral y la síntesis de proteínas. Desde entonces, se han dedicado numerosos esfuerzos al desarrollo de asRNA como candidatos a fármacos. En 1998, la FDA aprobó el primer fármaco basado en asRNA, el fomivirsen . Este oligonucleótido de 21 pares de bases se desarrolló para tratar la retinitis por citomegalovirus en pacientes con SIDA. Su mecanismo de acción consiste en dirigirse al ARNm transcrito del virus e inhibir, en consecuencia, la replicación del citomegalovirus. A pesar de que el fomivirsen se suspendió en 2004 debido a la pérdida de mercado, sirvió como un ejemplo exitoso e inspirador del uso de asRNA como dianas o candidatos a fármacos. ^{[ 5 ]}

Otro ejemplo del uso de un ARN antisentido como agente terapéutico es el mipomersén , aprobado por la FDA en 2013. El mipomersén se desarrolló para controlar el nivel de colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL) en pacientes con hipercolesterolemia familiar homocigótica (HoFH), una enfermedad genética autosómica dominante poco frecuente. Debido al alto nivel de colesterol total (650-1000 mg/dL) y del receptor de LDL (superior a 600 mg/dL) en la HoFH, los pacientes con esta enfermedad tienen un alto riesgo de padecer cardiopatía coronaria. Dado que se ha demostrado que la proteína apo-B-100 es necesaria para la producción de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y LDL, el mipomersén se une al ARNm de la apo-B-100 y lo dirige hacia la degradación dependiente de la ARNasa H. En definitiva, el mipomersén es capaz de reducir el nivel de LDL. ^{[ 8 ]}

Los primeros ARN antisentido (asRNA) descubiertos se encontraron en procariotas, incluyendo plásmidos , bacteriófagos y bacterias . Por ejemplo, en el plásmido ColE1, el asRNA denominado ARN I desempeña un papel importante en la determinación del número de copias del plásmido al controlar la replicación. La replicación de ColE1 depende de la transcripción de un ARN cebador llamado ARN II. Una vez transcrito, el ARN II se hibrida con su plantilla de ADN y posteriormente es escindido por la RNasa H. En presencia del asRNA ARN I, el ARN I y el ARN II forman un dúplex que introduce un cambio conformacional en el ARN II. En consecuencia, el ARN II no puede hibridar con su plantilla de ADN, lo que resulta en un bajo número de copias de ColE1. En el bacteriófago P22, el asRNA sar ayuda a regular entre el ciclo lítico y el lisogénico al controlar la expresión de Ant. ^{[ 9 ]} Además de expresarse en procariotas, los asRNA también se descubrieron en plantas. El ejemplo mejor descrito de regulación por ARN antisentido en plantas se encuentra en el gen Flowering Locus C (FLC) . El gen FLC en Arabidopsis thaliana codifica un factor de transcripción que previene la expresión de una serie de genes que inducen la transición floral. En ambientes fríos, el ARN antisentido del gen FLC, denominado COOLAIR, se expresa e inhibe la expresión de FLC mediante la modificación de la cromatina, lo que permite la floración. ^{[ 10 ]} Otro ejemplo bien estudiado es el gen DOG1 (Delay of Germination 1). Su nivel de expresión está regulado negativamente por el transcrito antisentido (asDOG1 o 1GOD) que actúa en cis. ^{[ 11 ]} En células de mamíferos, un ejemplo típico de regulación por ARN antisentido es la inactivación del cromosoma X. Xist , un ARN antisentido, puede reclutar el complejo represor de policomb 2 (PRC2), lo que resulta en la heterocromatinización del cromosoma X. ^{[ 3 ]}

Los ARN antisentido se pueden clasificar de diferentes maneras. En términos de mecanismos reguladores, algunos autores agrupan los asRNA en interacciones ARN-ADN, interacciones ARN-ARN ya sea en el núcleo o el citoplasma e interacciones ARN-proteína ( epigenéticas ). ^{[ 3 ]} Los ARN antisentido se pueden categorizar por el tipo de promotores que inician la expresión de los asRNA: promotores independientes, promotores bidireccionales compartidos o promotores crípticos. En términos de longitud, aunque el asRNA en general se clasifica como lncRNA , hay asRNA cortos con una longitud de menos de 200 pares de bases. Debido a que se ha descubierto que el mecanismo regulador de los asRNA es específico de la especie, los asRNA también se pueden clasificar por especie. ^{[ 1 ]} Una de las formas comunes de clasificar los asRNA es por dónde se transcriben los asRNA en relación con sus genes diana: cis-actantes y trans-actantes .

Los ARN antisentido cis se transcriben desde la hebra opuesta del gen diana en el locus del gen diana. A menudo muestran un alto grado o una complementariedad completa con el gen diana. Si el ARN antisentido cis regula la expresión génica mediante la unión al ARNm, solo puede unirse a ARNm individuales. Al interactuar con los ARNm diana, los ARN antisentido cis pueden bloquear la unión del ribosoma o reclutar ARNasa para degradar los ARNm diana. En consecuencia, la función de estos ARN antisentido cis es reprimir la traducción de los ARNm diana. ^{[ 2 ]} Además de los ARN antisentido cis que se unen a los ARNm, existen silenciadores y activadores epigenéticos cis . Se ha demostrado que el ARN antisentido reprime la traducción del dominio LINE1-ORF2 de Entamoeba histolytica . Sin embargo, aún no se ha confirmado si actúa en cis o en trans. ^{[ 12 ]}

En términos de modificación epigenética, el término cis-actuante se refiere a la naturaleza de estos ARN antisentido que regulan los cambios epigenéticos alrededor de los loci donde se transcriben. En lugar de dirigirse a ARNm individuales, estos reguladores epigenéticos cis-actuantes pueden reclutar enzimas modificadoras de la cromatina que pueden ejercer efectos tanto en los loci de transcripción como en los genes vecinos. ^{[ 3 ]}

Los ARN antisentido trans se transcriben a partir de loci distales a los genes diana. A diferencia de los ARN antisentido cis, presentan un bajo grado de complementariedad con el gen diana, pero pueden ser más largos. También pueden dirigirse a múltiples loci. Debido a estas propiedades, los ARN antisentido trans forman complejos menos estables con sus transcritos diana y, en ocasiones, requieren la ayuda de proteínas chaperonas de ARN como Hfq para ejercer sus funciones. Dada la complejidad de los ARN antisentido trans, actualmente se consideran dianas farmacológicas menos viables. ^{[ 2 ]}

Numerosos ejemplos de ARN antisentido muestran el efecto inhibidor sobre el inicio de la transcripción a través de modificaciones epigenéticas.

La metilación del ADN puede resultar en la regulación negativa a largo plazo de genes específicos. Se ha encontrado represión de proteínas funcionales a través de la metilación del ADN inducida por asRNA en varias enfermedades humanas. En una clase de alfa-talasemia , un tipo de trastorno sanguíneo que tiene un nivel reducido de hemoglobina que conduce a una oxigenación insuficiente en los tejidos, ^{[ 13 ]} el gen de la hemoglobina alfa1 (HBA1) está regulado negativamente por un transcrito anormal de la proteína putativa de unión a ARN Luc7-like (LUC71) que actúa como un asRNA para HBA1 e induce la metilación del promotor de HBA1. ^{[ 1 ]} Otro ejemplo es el silenciamiento de un gen supresor de tumores p15INK4b, también llamado CDKN2B, en la leucemia linfoblástica aguda y la leucemia mieloide aguda. El asRNA responsable de este efecto de silenciamiento es el ARN no codificante antisentido en el locus INK ( ANRIL ), que se expresa en el mismo locus que codifica para p15INK4b. ^{[ 3 ]}

In eukaryotic cells, DNA is tightly packed by histones. Modification on histones can change interactions with DNA which can further induce changes in gene expression. The biological consequences of histone methylation are context dependent. In general, histone methylation leads to gene repression but gene activation can also be achieved.^[14] Evidence has shown histone methylation can be induced by asRNAs. For instance, ANRIL, in addition to the ability to induce DNA methylation, can also repress the neighboring gene of CDKN2B, CDKN2A, by recruiting polycomb repressive complex 2 (PRC2) which leads to histone methylation (H3K27me). Another classic example is X chromosome inactivation by XIST.^[1]

ANRIL induced epigenetic modification is an example of cis acting epigenetic regulation.^[3] In addition, Antisense RNA-induced chromatin modification can be both trans-acting. For example, in mammals, the asRNA HOTAIR is transcribed from homeobox C (HOXC) locus but it recruits PRC2 to HOXD which deposits H3K27 and silences HOXD. HOTAIR is highly expressed in primary breast tumors.^[1]

Las regulaciones epigenéticas, como la metilación del ADN y la metilación de las histonas, pueden reprimir la expresión génica al inhibir el inicio de la transcripción. Sin embargo, a veces la represión génica se puede lograr terminando prematuramente o ralentizando el proceso de transcripción. Los ARN antisentido (asRNA) pueden estar involucrados en este nivel de regulación génica. Por ejemplo, en células bacterianas o eucariotas donde están presentes polimerasas de ARN complejas, la transcripción bidireccional en el mismo locus puede provocar una colisión de polimerasas y, como resultado, la terminación de la transcripción. Incluso cuando la colisión de polimerasas es improbable durante una transcripción débil, también puede ocurrir una pausa de la polimerasa que bloquea la elongación y conduce a la represión génica. Un ejemplo es la represión del gen IME4 por su asRNA RME2 . Otra forma de afectar la transcripción cotranscripcionalmente es bloqueando el empalme. Un ejemplo clásico en humanos es el gen ZEB2 ( zinc-finger E-box binding homeobox 2 ), que codifica la E-cadherina, un represor transcripcional. La traducción eficiente del ARNm de ZEB2 requiere la presencia de un sitio de entrada ribosómica interna (IRES) en el intrón del ARNm en el extremo 5' . Al expresarse el ARN antisentido (asRNA) de ZEB2, este puede enmascarar el sitio de empalme y mantener el IRES en el ARNm, lo que resulta en una síntesis eficiente de E-cadherina. Finalmente, dependiendo del nivel de expresión del asRNA, se pueden producir diferentes isoformas del transcrito en sentido directo. Por lo tanto, la regulación dependiente del asRNA no se limita a un mecanismo de activación/desactivación; más bien, presenta un sistema de control de tono preciso. ^{[ 1 ]}

La modulación postranscripcional directa por asRNAs se refiere a la acción directa de los asRNAs sobre los ARNm; por lo tanto, la traducción se ve afectada. Algunas características de este tipo de asRNAs se describen en los asRNAs de acción cis y trans. Este mecanismo es relativamente rápido porque tanto el ARNm diana como su asRNA deben estar presentes simultáneamente en la misma célula. Como se describe en los asRNAs de acción cis, el emparejamiento ARNm-asRNA puede resultar en el bloqueo de la entrada del ribosoma y la degradación dependiente de la RNasa H. En general, los asRNAs que actúan sobre el ARNm pueden activar o inhibir la traducción de los ARNm de sentido, siendo el efecto inhibitorio el más frecuente. ^{[ 1 ]}

Como elemento regulador, los ARN antisentido (asRNA) presentan numerosas ventajas para ser considerados como dianas farmacológicas. En primer lugar, los asRNA regulan la expresión génica en múltiples niveles, incluyendo la transcripción, la postranscripcional y la modificación epigenética. En segundo lugar, los asRNA cis-activos son específicos de secuencia y exhiben un alto grado de complementariedad con los genes diana. ^{[ 1 ]} En tercer lugar, el nivel de expresión de los asRNA es muy bajo en comparación con el de los ARNm diana; por lo tanto, se requiere una cantidad mínima de asRNA para producir un efecto. En términos de dianas farmacológicas, esto representa una gran ventaja, ya que se requiere una dosis baja para lograr la efectividad. ^{[ 4 ]}

En los últimos años, la idea de dirigir la acción de los ARN antisentido (asRNA) para aumentar la expresión génica de forma específica en un locus ha captado mucha atención. Debido a la naturaleza del desarrollo de fármacos , siempre es más sencillo contar con medicamentos que actúen como reguladores negativos o inhibidores. Sin embargo, existe la necesidad de desarrollar fármacos que puedan activar o regular positivamente la expresión génica, como la de los genes supresores de tumores, los factores de crecimiento neuroprotectores y los genes que se encuentran silenciados en ciertos trastornos mendelianos. Actualmente, el enfoque para restaurar la expresión génica o la función proteica deficiente incluye terapias de reemplazo enzimático, terapias con microARN y la administración de ADNc funcional. Sin embargo, cada una presenta ciertas desventajas. Por ejemplo, la proteína sintetizada utilizada en las terapias de reemplazo enzimático a menudo no puede imitar completamente la función de la proteína endógena. Además, las terapias de reemplazo enzimático implican un compromiso de por vida y una gran carga financiera para el paciente. Debido a la naturaleza específica de los asRNA y a las evidencias de cambios en su expresión en muchas enfermedades, se han realizado intentos para diseñar oligonucleótidos monocatenarios, denominados antagoNAT, para inhibir los asRNA y, en última instancia, aumentar la expresión génica específica. ^{[ 4 ]}

A pesar de las promesas de los asRNA como dianas farmacológicas o candidatos a fármacos, aún quedan algunos desafíos por abordar. ^{[ 15 ]} En primer lugar, los asRNA y los antagoNAT pueden ser fácilmente degradados por la RNasa u otras enzimas degradantes. Para prevenir la degradación de los oligonucleótidos terapéuticos, generalmente se requiere una modificación química. La modificación química más común en los oligonucleótidos es la adición de un enlace fosforotioato a las cadenas principales. ^{[ 5 ]} Sin embargo, la modificación con fosforotioato puede ser proinflamatoria. Se han observado efectos adversos, como fiebre, escalofríos o náuseas, después de la inyección local de oligonucleótidos modificados con fosforotioato. En segundo lugar, la toxicidad fuera de la diana también representa un gran problema. A pesar de la naturaleza específica del locus de los asRNA endógenos, solo entre el 10 y el 50 % de los oligonucleótidos sintetizados mostraron el efecto de direccionamiento esperado. Una posible razón de este problema es el alto requisito de que la estructura de los ARN antisentido sea reconocida por la secuencia diana y la RNasa H. Un solo desajuste puede provocar una distorsión en la estructura secundaria y dar lugar a efectos fuera de la diana. ^{[ 4 ]} Por último, se ha demostrado que los ARN antisentido artificiales tienen una captación intracelular limitada. ^{[ 5 ]} Aunque se ha demostrado que las neuronas y la glía tienen la capacidad de captar libremente oligonucleótidos antisentido desnudos, los transportadores rastreables, como los virus y las vesículas lipídicas, seguirían siendo ideales para controlar y monitorizar la concentración y el metabolismo intracelulares. ^{[ 4 ]}

• Transcripción antisentido cis-natural