ADN amplificado arbitrariamente

El ADN amplificado arbitrariamente ( AAD ) se refiere a una familia de métodos de perfilado de ADN que amplifican ácidos nucleicos molde con cebadores de oligonucleótidos arbitrarios mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El AAD incluye las primeras metodologías introducidas a principios de la década de 1990 en un lapso de solo unos meses: ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD), ^{[ 1 ]} PCR con cebadores arbitrarios (AP-PCR), ^{[ 2 ]} y huella genética por amplificación de ADN (DAF). ^{[ 3 ]} Estas técnicas se utilizaron inicialmente para la tipificación genética, la discriminación de cepas, el mapeo del genoma, el análisis filogenético y el análisis de poblaciones, en ese orden, y su uso posterior durante las décadas siguientes continúa influyendo en muchas áreas de investigación. Se introdujeron varias variantes en los primeros años después de su desarrollo ( ver listados iniciales ^{[ 4 ]} ), una de las cuales, el polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) ^{[ 5 ]} , se adoptó ampliamente.

Operacionalmente, DAF, AP-PCR y RAPD se pueden distinguir por la longitud de los cebadores arbitrarios y las proporciones de ADN cebador-molde utilizadas durante la amplificación. DAF emplea los cebadores más cortos y las proporciones cebador-molde más altas. RAPD utiliza longitudes de cebadores intermedias y las proporciones cebador-molde más bajas. AP-PCR utiliza los cebadores más largos y proporciones intermedias. Estas condiciones de amplificación hacen que DAF y AP-PCR produzcan patrones de huella genética más complejos que RAPD, lo que requiere una separación de alta resolución mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) desnaturalizante o nativa, seguida de tinción con plata o marcaje radiactivo .

Las técnicas DAF y AP-PCR han demostrado ser altamente reproducibles cuando las condiciones de amplificación se controlan adecuadamente, mientras que la técnica RAPD se considera menos reproducible. La RAPD se basa en cebadores cortos y bajas concentraciones de cebadores en condiciones de baja rigurosidad, lo que hace que la amplificación sea muy sensible a pequeñas variaciones en la composición de la reacción, la calidad del ADN y los parámetros del ciclo térmico. Como resultado, los perfiles RAPD son más propensos a la variabilidad entre laboratorios e incluso entre ensayos dentro del mismo laboratorio. Estas diferencias en la reproducibilidad fueron un factor importante que llevó a la preferencia por DAF y AP-PCR en aplicaciones que requieren huellas genéticas de ADN de alta resolución y consistentes.

En la literatura inicial (1990-1995), la familia colectiva de métodos que incluye RAPD, DAF y AP-PCR se describió utilizando varios términos generales superpuestos antes de que la nomenclatura se estabilizara. En los primeros informes, los términos RAPD y AP-PCR se usaban a menudo de forma imprecisa para describir todo el enfoque. El reconocimiento de que estos métodos diferían operativamente llevó a la introducción de descriptores comparativos, incluidos el perfilado de amplicones arbitrarios múltiples (MAAP) ^{[ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]} (que enfatiza el perfilado de muchos amplicones ), el ADN amplificado arbitrariamente ^{[ 9 ]} (que enfatiza los cebadores arbitrarios como características definitorias), el escaneo de ácidos nucleicos ^{[ 4 ]} (que enfatiza la función de exploración del genoma) y la PCR con cebadores arbitrarios (que enfatiza el mecanismo de PCR). A mediados de la década de 1990, AAD se había consolidado como el término general (enciclopédico) más preciso desde el punto de vista técnico para esta familia de métodos, aunque algunas publicaciones posteriores continuaron agrupando estos enfoques bajo métodos afiliados a RAPD. ^{[ 10 ]} Cabe señalar que el término RAPD resulta algo engañoso, ya que los cebadores y el proceso de amplificación son arbitrarios en lugar de aleatorios. ^{[ 7 ]}

Varias variantes de AAD mejoran la capacidad de escaneo del genoma de los métodos tradicionales. Mini-hairpin DAF (mhpDAF) aumenta la cobertura y la resolución al favorecer el anillamiento extendido influenciado por la estructura durante la amplificación secundaria. ^{[ 11 ]} Arbitrary signatures from amplification profiles (ASAP) emplea una reamplificación en dos pasos con cebadores mini-hairpin, lo que permite el uso combinatorio de cebadores para producir huellas dactilares altamente discriminatorias. ^{[ 12 ]} Template endonuclease–cleaved multiple arbitrary amplicon profiling (tecMAAP) mejora aún más la resolución al digerir el ADN molde con enzimas de restricción antes de la amplificación, alterando la cinética del cebador-molde y amplificando selectivamente sitios variables para mejorar la discriminación entre genotipos estrechamente relacionados. ^{[ 13 ]} De manera similar, el método de polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), ampliamente utilizado ^{[ 5 ],} muestrea múltiples loci genómicos sin información de secuencia previa, pero lo hace mediante la digestión del ADN con enzimas de restricción, la ligación de adaptadores y la amplificación selectiva de subconjuntos de fragmentos. Estos enfoques producen huellas genéticas multilocus altamente reproducibles que son menos sensibles a las condiciones de la PCR, lo que permite análisis robustos de la diversidad genética, la estructura poblacional y la filogeografía. El popular AFLP, en particular, conserva las ventajas del muestreo anónimo de todo el genoma, al tiempo que cierra la brecha metodológica entre los marcadores RAPD de bajo costo y los enfoques de secuenciación de alto rendimiento.

Los métodos de secuenciación de representación reducida, como la secuenciación de ADN asociada a sitios de restricción (RAD-seq), son enfoques de perfilado de ADN de alto rendimiento que permiten el descubrimiento de marcadores a nivel genómico y la genotipificación para aplicaciones que incluyen mapeo de asociación, análisis de QTL, genética de poblaciones, genómica ecológica y biología evolutiva. ^{[ 14 ]} RAD-seq, formalizado originalmente por Baird et al., ^{[ 15 ]} se dirige a un subconjunto reproducible del genoma mediante la digestión del ADN genómico con enzimas de restricción, la ligación de adaptadores de secuenciación (que a menudo incorporan códigos de barras específicos de la muestra), la selección de tamaño y la secuenciación de los fragmentos resultantes en plataformas de alto rendimiento como los sistemas Illumina. La variación genética se caracteriza entonces principalmente a través del descubrimiento de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) y la genotipificación en loci adyacentes a los sitios de restricción.

Aunque los métodos modernos de secuenciación de representación reducida son tecnológicamente distintos, reviven la lógica subyacente de AAD: reducción de la complejidad del genoma seguida de muestreo multilocus anónimo sin conocimiento previo de la secuencia y extracción de información genética comparativa. AAD logra esto mediante amplificación de baja stringencia con cebadores arbitrarios, generando perfiles de fragmentos multilocus ricos en información (particularmente en DAF y AFLP) generalmente mediante cebado de baja stringencia. RAD-seq, en cambio, reduce la complejidad mediante digestión con enzimas de restricción, secuenciando selectivamente fragmentos adyacentes a los sitios de corte e identificando miles o millones de SNP en loci distribuidos. La distinción es, por lo tanto, tecnológica más que conceptual: mientras que AAD infiere la variación a partir de polimorfismos del tamaño de los fragmentos, RAD-seq resuelve la variación genética directamente a nivel de nucleótido.

Sorprendentemente, los análisis comparativos de marcadores AAD y RAD-seq muestran que las técnicas AAD pueden delimitar de forma robusta las relaciones evolutivas tanto en plantas como en animales, a menudo arrojando conclusiones congruentes con las obtenidas a partir de conjuntos de datos RAD-seq. ^{[ 16 ]} Cuando el objetivo principal es la delimitación de entidades evolutivas —un objetivo central en la investigación de la biodiversidad, la sistemática y la genética de la conservación— los enfoques AAD siguen siendo metodológicamente adecuados, evitando al mismo tiempo las importantes exigencias financieras y de infraestructura asociadas con la secuenciación de alto rendimiento. Por lo tanto, la elección entre AAD y RAD-seq no es solo una cuestión de poder inferencial, sino también de viabilidad práctica.

Esta distinción tiene importantes implicaciones globales. Muchos de los países económicamente desfavorecidos del mundo albergan una proporción desproporcionada de la biodiversidad global, pero siguen estando subrepresentados en la investigación genómica debido a la financiación insuficiente crónica y al acceso limitado a la infraestructura de secuenciación. Los patrones de publicación muestran que la financiación para la investigación RAD-seq y AFLP se concentra en naciones económicamente prósperas, ^{[ 16 ]} lo que resalta el valor de los métodos AAD de menor coste, como DAF, que son más accesibles en regiones con recursos limitados. Dado que estas áreas contienen gran parte de la biodiversidad del planeta, los científicos e instituciones locales serán fundamentales para abordar la crisis de la biodiversidad. ^{[ 17 ]} Por lo tanto, garantizar el acceso a herramientas filogeográficas asequibles para identificar unidades evolutivas relevantes para la conservación y superar el impedimento taxonómico no es meramente una consideración técnica, sino un imperativo estratégico para la investigación global de la biodiversidad.

• Amplificación aleatoria de ADN polimórfico
• PCR con cebadores arbitrarios
• huella genética por amplificación de ADN
• Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados