huella genética por amplificación de ADN

La técnica de huella genética por amplificación de ADN (DAF) es una técnica de perfilado de ADN de alta sensibilidad que genera huellas genómicas complejas y reproducibles sin conocimiento previo de la información de la secuencia. Desarrollada a principios de la década de 1990 por Gustavo Caetano-Anollés y sus colegas en la Universidad de Tennessee , ^{[ 2 ]} la DAF ofreció una alternativa de alta resolución a los métodos de escaneo de ácidos nucleicos, como el ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD), la PCR con cebadores arbitrarios (AP-PCR) y el polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), para la tipificación genética, la discriminación de cepas, el mapeo del genoma y el análisis de poblaciones.

DAF emplea cebadores de oligonucleótidos arbitrarios únicos y muy cortos, típicamente de 5 a 8 nucleótidos (nt) de longitud, y una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar múltiples regiones anónimas dispersas por todo el genoma . ^{[ 3 ]} Debido a que los cebadores son extremadamente cortos, se hibridan en numerosos sitios parcialmente complementarios. Cuando dos sitios se encuentran en orientación opuesta y dentro de una distancia amplificable (generalmente < 3–5 kb), se amplifica el segmento intermedio. La resolución de los productos resultantes mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) desnaturalizante o nativa de alta resolución, seguida de tinción con plata , produce de docenas a cientos de bandas que juntas forman una "huella dactilar" genómica característica, y las bandas individuales a menudo sirven como marcadores genéticos. ^{[ 4 ]}

La técnica DAF se distingue de otras técnicas de amplificación de ADN arbitraria por su alta relación cebador-plantilla, su sencillez procedimental, su gran reproducibilidad y su elevada capacidad de multiplexación. Además de genomas completos, permite generar huellas genéticas a partir de fragmentos subgenómicos, como productos de PCR amplificados, ADN clonado y poblaciones de ADN complementario (ADNc).

DAF se basa en una ADN polimerasa termoestable (por ejemplo, la polimerasa Taq o versiones truncadas de la enzima, como el fragmento de Stoffel) que opera bajo una baja rigurosidad de hibridación para lograr la amplificación dirigida por cebadores del ADN genómico . ^{[ 2 ] [ 3 ]} La enzima amplifica segmentos genómicos ubicados entre sitios de unión de cebadores orientados inversamente. Los amplicones iniciales que surgen de regiones anónimas entre estos sitios se convierten en "plantillas preferenciales" en ciclos subsiguientes porque llevan complementos de cebadores perfectos en sus extremos. Como resultado, los productos de extensión de un ciclo sirven como plantillas óptimas para un cebado y síntesis adicionales en el siguiente, lo que lleva a un enriquecimiento exponencial de estos fragmentos. El resultado es una mezcla compleja de fragmentos de ADN de tamaños y abundancias variables que reflejan la distribución genómica de motivos cortos de coincidencia de cebadores, distancias entre ellos, polimorfismos de secuencia que crean o eliminan sitios de cebado e inserciones/deleciones (indels) que alteran la longitud del fragmento. De esta forma, DAF revela el polimorfismo sin necesidad de dirigirse a loci específicos.

Caetano-Anollés et al . propusieron un modelo mecanicista para la amplificación de ADN con cebadores arbitrarios ^{[ 5 ]} (pero también véase ^{[ 3 ] [ 6 ]} ). El modelo enfatiza la interacción competitiva entre las interacciones cebador-molde y molde-molde que se establecen principalmente durante los primeros ciclos de amplificación por PCR. ^{[ 5 ] [ 7 ]} Durante esta fase inicial de selección del molde, un subconjunto de regiones genómicas se recluta preferentemente para la amplificación a través de interacciones cebador-molde-enzima que toleran desajustes sustanciales, lo que permite que cebadores arbitrarios muy cortos se hibriden en múltiples sitios. Una vez que ocurre la extensión, los productos de amplificación de la primera ronda son moléculas monocatenarias que a menudo contienen secuencias complementarias invertidas en sus extremos. Estas secuencias promueven el apareamiento de bases intramolecular (formación de bucles en horquilla) y la formación de dúplex intermolecular a través del hibridación molde-molde, introduciendo conformaciones estructurales competitivas en ciclos posteriores. Los cebadores deben entonces reconocer, invadir y desplazar estas estructuras para permitir la unión de la polimerasa y la extensión. En consecuencia, solo los amplicones iniciales cuyas conformaciones permiten un acceso eficiente al cebador continúan amplificándose eficazmente. Finalmente, a medida que avanza la amplificación, la reacción se aproxima a un equilibrio dinámico entre cadenas simples, horquillas, dúplex, complejos cebador-molde e intermediarios unidos a la enzima que compiten entre sí. Dentro de esta mezcla, los dúplex cebador-molde, relativamente escasos pero productivos, se convierten continuamente en productos que se acumulan, generando los patrones de bandas complejos pero reproducibles característicos de la DAF.

Este modelo explica por qué las técnicas de escaneo del genoma amplifican un subconjunto definido y reproducible de fragmentos genómicos en lugar de muestrear el genoma al azar, y por qué los resultados están determinados en gran medida por los eventos que ocurren en los primeros ciclos de PCR.

Los cebadores se seleccionan arbitrariamente y se utilizan en altas concentraciones (3-30 μM) en comparación con las típicas de AP-PCR (1-10 μM) y RAPD (0,3 μM). ^{[ 6 ]} Sus secuencias no están diseñadas para dirigirse a ningún gen o región genómica específica conocida. Las longitudes de los cebadores se aproximan a la configuración mínima capaz de soportar la amplificación del ADN. ^{[ 3 ] [ 5 ] [ 8 ]} La amplificación exitosa requiere cebadores de al menos 5 nt, pero preferiblemente 8 nt de longitud, con hibridación que depende de la homología perfecta con los primeros 5-6 nt desde el extremo 3'. ^{[ 5 ]} La corta longitud del cebador promueve el cebado tolerante a desajustes, lo que resulta en la amplificación de docenas a cientos de fragmentos de tamaño variable.

Los cebadores pueden ser evaluados por su capacidad para detectar polimorfismos. Por ejemplo, en estudios de diversidad genética en lupino blanco ( Lupinus albus ), se evaluaron 56 cebadores octaméricos, de los cuales 22 produjeron patrones DAF altamente polimórficos útiles para distinguir accesiones. ^{[ 9 ]} Los cebadores también pueden ser elegidos para modular la complejidad del perfil de ADN. ^{[ 6 ] [ 10 ]} Los cebadores muy cortos (5-6 nt de longitud) tienden a producir patrones de bandas simples que se asemejan a los de RAPD, ^{[ 5 ]} mientras que los cebadores más largos (≥ 20 nt) pueden usarse de manera reproducible ^{[ 11 ]} pero a menudo producen perfiles menos complejos. ^{[ 6 ]} Los cebadores diseñados para contener una minihorquilla extraordinariamente estable ^{[ 12 ]} en el extremo 5' permiten la reducción de la secuencia arbitraria 3' a tan solo 3 nt, lo que permite la amplificación controlada de plantillas de baja complejidad como plásmidos y fragmentos de PCR al tiempo que aumenta la detección de ADN polimórfico. ^{[ 7 ]} La incorporación de grupos reporteros (por ejemplo, fluoróforos o biotina ) en el extremo 5' o el uso de bases degeneradas dentro de la secuencia del cebador, puede adaptar aún más la complejidad del perfil de ADN y facilitar la huella genética de variantes. ^{[ 7 ]} Las sustituciones con inosina generalmente simplifican los patrones, mientras que las sustituciones con cualquiera de los cuatro nucleótidos posibles aumentan la complejidad del perfil.

Las reacciones se optimizan para una alta rigurosidad, pero aún así son lo suficientemente permisivas para múltiples eventos de cebado. ^{[ 13 ]} Debido a que muchas variables interactivas afectan la eficiencia de amplificación y los patrones de bandas, la optimización es laboriosa y generalmente se basa en experimentos iterativos o diseñados estadísticamente (por ejemplo, análisis de matriz, ^{[ 14 ]} diseños factoriales fraccionados , ^{[ 15 ]} o métodos de diseño experimental de Taguchi ^{[ 1 ]} ) en lugar de pruebas exhaustivas. Un determinante central del rendimiento de DAF es la muy alta relación cebador-plantilla, con la concentración de cebador, la cantidad de plantilla y la calidad del ADN influyendo en la reproducibilidad. La elección de la ADN polimerasa termoestable es crítica, ya que diferentes enzimas producen huellas dactilares marcadamente diferentes. Se prefieren las enzimas truncadas, como el fragmento de Stoffel, por su estabilidad y tolerancia a niveles variables de magnesio. ^{[ 14 ]} Los componentes iónicos, especialmente el magnesio y su interacción con los cebadores, los dNTP y los iones del tampón, modulan fuertemente la rigurosidad de la amplificación, lo que hace que las formulaciones de tampón universales sean poco prácticas en todas las enzimas. Los parámetros del ciclo térmico, en particular la temperatura de recocido y el tiempo de desnaturalización, determinan el rendimiento y la distribución del producto, aunque muchos parámetros tienen amplias tolerancias una vez que se ajustan dentro de los rangos adecuados.

Los perfiles de ADN se resuelven típicamente mediante PAGE y tinción con plata, ^{[ 16 ]} pero también pueden generarse utilizando electroforesis en gel de agarosa , electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE), ^{[ 17 ]} electroforesis en gel con barrido de temperatura (TSGE), ^{[ 18 ]} o plataformas automatizadas como secuenciadores de ADN o electroforesis capilar (CE). Los productos de amplificación pueden visualizarse mediante tinción con plata , colorantes intercalantes fluorescentes (p. ej. , bromuro de etidio ) o marcaje radiactivo. Los geles de poliacrilamida teñidos con plata y con soporte de poliéster pueden conservarse durante décadas, a menudo almacenados en álbumes fotográficos. Estos geles permiten un escaneo densitométrico directo de los perfiles de ADN y sirven tanto como registros experimentales como depósitos físicos de ADN amplificado. Los productos de amplificación teñidos con plata pueden aislarse de los geles secos, reamplificarse, clonarse y secuenciarse. ^{[ 19 ] [ 20 ]}

Las variantes de DAF incluyen mini-hairpin DAF (mhpDAF), ^{[ 7 ]} firmas arbitrarias de perfiles de amplificación (ASAP), ^{[ 22 ]} y plantilla endonucleasa escindida perfilado de amplicones arbitrarios múltiples (tecMAAP). ^{[ 23 ]} mhpDAF aumenta sustancialmente la detección de ADN polimórfico durante la huella genética al sondear una porción efectiva mayor del genoma a través de interacciones de hibridación extendidas e influenciadas por la estructura. Esta capacidad de escaneo ampliada puede mejorar drásticamente la resolución (hasta 5 veces) al seleccionar preferentemente amplicones con sitios de hibridación extendidos durante la amplificación secundaria. ASAP vuelve a amplificar los productos de DAF (u otros PCR) utilizando cebadores mini-hairpin. Esta estrategia de dos pasos permite el uso combinatorio de cebadores, de modo que diferentes pares de cebadores producen huellas genéticas distintas, ampliando enormemente el poder discriminatorio, especialmente cuando se multiplexan. tecMAAP mejora la detección de polimorfismos (hasta 100 veces) al digerir el ADN plantilla con endonucleasas de restricción antes de DAF. La restricción reduce la longitud de la plantilla, altera la cinética del cebador-plantilla y elimina o crea amplicones preferenciales según la variación de secuencia en los sitios de restricción, aumentando así la discriminación de secuencia de genotipos muy relacionados. Las variantes de DAF también incluyen modificaciones en la resolución posterior a la amplificación de los productos de amplificación. Por ejemplo, la huella genética de ADN amplificada aleatoriamente (RAF) ^{[ 21 ]} mejora la resolución del perfil al marcar los amplicones con 33P radiactivo ^o fluorescencia y resolverlos en geles de secuenciación de poliacrilamida de gran tamaño. Este formato produce patrones de bandas altamente reproducibles, genera una fracción medible de marcadores codominantes y se compara favorablemente con el polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) tanto en eficiencia analítica como en fiabilidad.

DAF y sus variantes se han utilizado para la identificación de cepas, especies y líneas celulares, genética de poblaciones y filogeografía, mapeo de ligamiento y descubrimiento de marcadores, evaluación de la diversidad genómica, tipificación microbiana y epidemiología, y discriminación de cultivares de plantas y hongos. Los ejemplos incluyen la huella genética de bacterias ^{[ 14 ]} (por ejemplo, Acinetobacter baumaniaislamientos de pacientes de la unidad de cuidados intensivos, ^{[ 24 ]} poblaciones bacterianas mixtas en biorreactores de cultivo ^{[ 25 ]} ), análisis de poblaciones de hongos causantes de mildiú velloso ( Pseudoperonospora humuli ), ^{[ 26 ]} desarrollo de marcadores de región amplificada caracterizada por secuencia (SCAR) y DAF de hongos celomicetos ( Boeremia exigua ), ^{[ 27 ]} análisis de hongos Discula destructiva causantes de antracnosis del cornejo , ^{[ 28 ]} análisis de poblaciones de hongos de anillos de hadas ( Marasmius oreades ), ^{[ 29 ]} identificación de insectos ^{[ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]} y líneas celulares humanas, ^{[ 33 ]} análisis de diversidad genética de batata ( Ipomoeba batatas ), ^{[ 34 ]} ñame ( Dioscorea sp.), ^{[ 35 ]} y el género pantropical Vigna , ^{[ 36 ]} y mapeo genético y análisis de segregantes agrupados en guisante, ^{[ 37 ]} soja, ^{[ 38 ]} y garbanzo. ^{[ 39 ]}

DAF es una técnica temprana de huella genética de alta resolución, particularmente valorada desde la década de 1990 hasta finales de la década de 2000 para la tipificación genética rápida en microbios, plantas y otros organismos. La llegada de los flujos de trabajo de secuenciación de próxima generación (NGS) para el análisis del genoma completo y para el descubrimiento dirigido de microsatélites , polimorfismos de un solo nucleótido y otras regiones genómicas específicas, incluidos los marcadores de ADN asociados a sitios de restricción (RAD), promete desplazar los métodos de escaneo genómico más simples, incluidos DAF, RAPD, AP-PCR y AFLP, y sus variantes. Sin embargo, DAF sigue siendo valioso para la huella genética genómica rápida y de bajo costo, el análisis retrospectivo de perfiles archivados, la recuperación de amplicones anónimos para secuenciación y estudios exploratorios de variación genómica donde los enfoques de alto rendimiento no son prácticos ( ver ADN amplificado arbitrariamente ).

DAF no requiere conocimiento previo de la secuencia de ADN, lo que permite su aplicación a prácticamente cualquier organismo o construcción genética. El método es rápido, reproducible y técnicamente sencillo (típicamente, de 3 a 10 h, dependiendo del termociclador ), proporciona alta resolución y reproducibilidad, permite la conservación a largo plazo de huellas genéticas y es particularmente útil para distinguir organismos estrechamente relacionados donde otros métodos revelan poca variación. Estas propiedades separan a DAF del RAPD, notoriamente dependiente del laboratorio. Sin embargo, DAF requiere una optimización cuidadosa de las condiciones de reacción y generalmente genera marcadores dominantes, lo que dificulta la discriminación de heterocigotos. No obstante, los productos de DAF pueden recuperarse de geles de poliacrilamida o agarosa, clonarse y convertirse en marcadores SCAR codominantes, ^{[ 40 ]} lo que permite distinguir entre individuos heterocigotos y homocigotos.

• ADN amplificado arbitrariamente
• Amplificación aleatoria de ADN polimórfico
• PCR con cebadores arbitrarios
• Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados

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