PCR con cebadores arbitrarios

La reacción en cadena de la polimerasa con cebadores arbitrarios (AP-PCR) es una técnica de huella genética de ADN desarrollada en 1990 por John Welsh y Michael McClelland . ^{[ 2 ]} El método amplifica múltiples loci anónimos utilizando un único cebador corto de secuencia arbitraria en condiciones de baja rigurosidad. Los fragmentos amplificados se separan típicamente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) y se visualizan con marcaje radiactivo para producir patrones de bandas multilocus característicos. La AP-PCR no requiere información de secuencia previa y fue uno de los primeros enfoques de escaneo del genoma basados ​​en PCR desarrollados para la elaboración rápida de perfiles de ADN ( véase ADN amplificado arbitrariamente ).

La AP-PCR surgió durante la expansión inicial de los sistemas de marcadores basados ​​en PCR. El ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD), descrito por Williams y colaboradores, ^{[ 3 ]} fue el primero en demostrar que cebadores arbitrarios individuales podían generar marcadores polimórficos multilocus sin información de secuencia previa. Poco después, Welsh y McClelland demostraron que condiciones similares de PCR con cebadores arbitrarios podían producir de forma reproducible huellas genómicas de bacterias y otros organismos, estableciendo el enfoque de la AP-PCR. ^{[ 2 ]} La huella genética por amplificación de ADN (DAF), introducida posteriormente por Caetano-Anollés y colaboradores, amplió aún más la estrategia mediante el uso de cebadores más cortos y detección electroforética de alta resolución. ^{[ 4 ]} En conjunto, estos métodos establecieron el marco conceptual de la PCR con cebadores arbitrarios y la generación de marcadores multilocus anónimos. Aunque inicialmente se enfatizaron las distinciones terminológicas, RAPD, AP-PCR y DAF se reconocen ahora generalmente como variantes metodológicas dentro de la clase más amplia de técnicas de ADN amplificado arbitrariamente (AAD).

AP-PCR utiliza un único cebador de oligonucleótido, típicamente de 18 a 32 nucleótidos de longitud, bajo condiciones de menor rigor de hibridación durante los primeros ciclos de amplificación. ^{[ 5 ]} La complementariedad imperfecta entre el cebador y la plantilla permite la unión en múltiples ubicaciones genómicas. Cuando dos sitios de unión del cebador se encuentran dentro de una distancia amplificable y en orientación opuesta, la amplificación exponencial produce fragmentos discretos. Ciclos posteriores con mayor rigor estabilizan selectivamente la amplificación de productos coincidentes. El perfil de bandas resultante refleja un subconjunto de loci genómicos definidos por la secuencia del cebador, los parámetros de termociclado, la fuerza iónica y la composición de la plantilla. Los polimorfismos surgen de sustituciones de nucleótidos o inserciones/deleciones en los sitios de unión del cebador, así como de la variación de longitud entre sitios. Dado que los marcadores se puntúan como presencia/ausencia de bandas, los loci AP-PCR suelen ser dominantes.

AP-PCR se ha aplicado en la tipificación de cepas microbianas, investigaciones epidemiológicas, genética de poblaciones y mapeo genético preliminar. ^{[ 6 ]} En bacterias y hongos, permite una discriminación rápida entre aislados estrechamente relacionados. Algunos ejemplos incluyen el seguimiento de brotes en entornos hospitalarios (por ejemplo, Bacillus licheniformis ^{[ 1 ]} ) u odontológicos ^{[ 7 ]} . En plantas y animales, los marcadores AP-PCR se han utilizado para estimar la diversidad genética, identificar cultivares o cepas y construir mapas de ligamiento de baja resolución. Un ejemplo es la identificación de un gen asociado con tumores de Wilms en humanos. ^{[ 8 ]} Antes de la adopción generalizada de plataformas de secuenciación de alto rendimiento y genotipado de microsatélites o SNP, AP-PCR proporcionó una estrategia eficiente para el muestreo de todo el genoma en organismos no modelo.

La AP-PCR se adaptó posteriormente para el análisis de poblaciones de ARN mediante transcripción inversa seguida de amplificación por PCR con cebadores arbitrarios. ^{[ 9 ] En este enfoque, el ADN complementario (ADNc) sintetizado a partir de ARN total o mensajero sirve como plantilla para la amplificación con cebadores arbitrarios únicos en condiciones de baja rigurosidad. [ 10 ]} Los patrones de bandas resultantes reflejan subconjuntos de transcritos expresados ​​en lugar de loci genómicos, lo que permite el análisis comparativo de la expresión génica entre tejidos, etapas de desarrollo o condiciones ambientales. Esta estrategia proporcionó la base conceptual para las metodologías de visualización diferencial y las primeras técnicas de perfilado de transcritos antes del advenimiento de las plataformas de expresión de alto rendimiento.

La AP-PCR se caracteriza por su simplicidad técnica, bajo costo y requisitos mínimos de ADN. Se pueden generar múltiples loci polimórficos en una sola reacción sin conocimiento genómico previo. Sin embargo, los perfiles de amplificación son sensibles a las condiciones de reacción, incluyendo la concentración de magnesio, el diseño de los cebadores, los parámetros de termociclado y la calidad de la plantilla. Por lo tanto, la reproducibilidad entre laboratorios puede variar si los protocolos no están estandarizados. ^{[ 11 ]} La naturaleza dominante de los marcadores también limita la evaluación directa de la heterocigosidad. Con el desarrollo de las tecnologías de genotipado basadas en secuencias, la AP-PCR ha sido en gran medida reemplazada para aplicaciones de alta resolución, aunque sigue siendo útil para el cribado genómico rápido y económico.

• ADN amplificado arbitrariamente
• Amplificación aleatoria de ADN polimórfico
• huella genética por amplificación de ADN
• Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados