Hibridación genómica comparativa

El ADN en la lámina es una muestra de referencia y, por lo tanto, se obtiene de un hombre o una mujer con cariotipo normal, aunque es preferible usar ADN femenino ya que poseen dos cromosomas X que contienen mucha más información genética que el cromosoma Y masculino. Se utilizan linfocitos de sangre periférica estimulados con fitohemaglutinina. Se añade 1 ml de sangre heparinizada a 10 ml de medio de cultivo y se incuba durante 72 horas a 37  °C en una atmósfera de 5 % de CO₂ _. Se añade colchicina para detener las células en mitosis, luego se recolectan las células y se tratan con cloruro de potasio hipotónico y se fijan en metanol / ácido acético 3:1 . ^{[ 3 ]}

Una gota de la suspensión celular debe depositarse sobre un portaobjetos limpio con etanol desde una distancia de aproximadamente 30  cm. Idealmente, esto debe realizarse a temperatura ambiente y con una humedad relativa del 60-70%. Los portaobjetos deben evaluarse mediante visualización con un microscopio de contraste de fases: debe observarse un mínimo de citoplasma y los cromosomas no deben superponerse, deben tener una longitud de 400-550 bandas sin cromátidas separadas y, finalmente, deben aparecer oscuros en lugar de brillantes. Los portaobjetos deben secarse al aire durante la noche a temperatura ambiente, y cualquier almacenamiento posterior debe realizarse en grupos de cuatro a -20  °C con perlas de sílice o nitrógeno para mantener la sequedad. Deben probarse diferentes donantes, ya que la hibridación puede variar. Se pueden utilizar portaobjetos disponibles comercialmente, pero siempre deben probarse primero. ^{[ 3 ]}

La extracción estándar con fenol se utiliza para obtener ADN de tejido de prueba o de referencia (individuo con cariotipo normal), que consiste en la combinación de ácido tris - etilendiaminotetraacético y fenol con ADN acuoso en cantidades iguales. A continuación, se realiza una separación mediante agitación y centrifugación, tras lo cual se retira la capa acuosa y se trata posteriormente con éter . Finalmente, se utiliza la precipitación con etanol para concentrar el ADN. ^{[ 3 ]}

Puede completarse utilizando kits de aislamiento de ADN disponibles comercialmente que se basan en columnas de afinidad . ^{[ 3 ]}

Preferiblemente, el ADN debe extraerse de tejido fresco o congelado, ya que esto garantizará la máxima calidad. Sin embargo, actualmente es posible utilizar material de archivo fijado con formalina o incluido en parafina , siempre que se sigan los procedimientos adecuados. 0,5-1  μg de ADN son suficientes para el experimento de CGH. Si no se obtiene la cantidad deseada, se puede aplicar DOP-PCR para amplificar el ADN; en este caso, es importante aplicar DOP-PCR tanto a la muestra de ADN de prueba como a la de referencia para mejorar la fiabilidad. ^{[ 3 ]}

La técnica de marcaje por muescas se utiliza para etiquetar el ADN e implica cortar el ADN y sustituir nucleótidos marcados con fluoróforos (etiquetado directo) o biotina u oxigenina para añadir posteriormente anticuerpos conjugados con fluoróforos (etiquetado indirecto). Es importante comprobar la longitud de los fragmentos tanto del ADN de prueba como del ADN de referencia mediante electroforesis en gel , ya que deben estar dentro del rango de 500 kb a 1500 kb para una hibridación óptima. ^{[ 3 ]}

Se añade ADN Cot-1 sin etiquetar de Life Technologies Corporation (ADN placentario enriquecido con secuencias repetitivas de longitud 50-100 pb) para bloquear las secuencias de ADN repetitivas normales, particularmente en los centrómeros y telómeros , ya que estas secuencias, si se detectan, pueden reducir la relación de fluorescencia y hacer que las ganancias o pérdidas escapen a la detección. ^{[ 3 ]}

Se mezclan 8–12 μl de cada ADN de prueba marcado y ADN de referencia marcado, y  se añaden 40 μg de ADN Cot-1. A continuación, se precipita y posteriormente se disuelve en 6 μl de mezcla de hibridación, que contiene 50 % de formamida para disminuir la temperatura de fusión del ADN y 10 % de sulfato de dextrano para aumentar la concentración efectiva de la sonda en una solución salina de citrato de sodio (SSC) a un pH de 7,0. ^{[ 3 ]}

La desnaturalización de la lámina y las sondas se realiza por separado. La lámina se sumerge en formamida al 70 %/2xSSC durante 5-10 minutos a 72  °C, mientras que las sondas se desnaturalizan por inmersión en un baño de agua a 80  °C durante 10 minutos y se añaden inmediatamente a la preparación de la lámina de metafase. Esta reacción se cubre con un cubreobjetos y se deja durante dos a cuatro días en una cámara húmeda a 40  °C. ^{[ 3 ]}

A continuación, se retira el cubreobjetos y se realizan lavados de 5 minutos: tres con 2xSSC a temperatura ambiente, uno a 45  °C con 0,1xSSC y uno con TNT a temperatura ambiente. La reacción se preincuba durante 10 minutos, seguida de una incubación de 60 minutos a 37  °C, tres lavados más de 5 minutos con TNT y uno con 2xSSC a temperatura ambiente. Finalmente, la lámina se seca con una serie de etanol al 70 %/96 %/100 % antes de la contratinción con DAPI (0,35 μg/ml) para la identificación de cromosomas y el sellado con un cubreobjetos. ^{[ 3 ]}

Para la visualización se requiere un microscopio de fluorescencia con los filtros adecuados para la tinción DAPI y los dos fluoróforos utilizados. Estos filtros también deben minimizar la interferencia entre los fluoróforos, como por ejemplo los filtros de paso de banda estrecha. El microscopio debe proporcionar una iluminación uniforme sin variación cromática , estar correctamente alineado y tener un objetivo plano apocromático con un aumento de 63x o 100x. ^{[ 3 ]}

La imagen debe registrarse utilizando una cámara con una resolución espacial de al menos 0,1  μm a nivel de la muestra y proporcionar una imagen de al menos 600x600 píxeles. La cámara también debe ser capaz de integrar la imagen durante al menos 5 a 10 segundos, con una resolución fotométrica mínima de 8 bits. ^{[ 3 ]}

Existe software CGH específico disponible comercialmente para el paso de procesamiento de imágenes, y es necesario para sustraer el ruido de fondo, eliminar y segmentar materiales que no son de origen cromosómico, normalizar la relación de fluorescencia, realizar cariotipado interactivo y escalado cromosómico a longitud estándar. Un "cariotipo de número de copias relativo", que presenta áreas cromosómicas de deleciones o amplificaciones, se genera promediando las relaciones de varias metafases de alta calidad y representándolas en un ideograma, un diagrama que identifica los cromosomas basándose en patrones de bandas. La interpretación de los perfiles de relación se realiza utilizando umbrales fijos o estadísticos ( intervalos de confianza ). Al utilizar intervalos de confianza, se identifican ganancias o pérdidas cuando el 95 % de la relación de fluorescencia no contiene 1,0. ^{[ 3 ]}

Se debe tener sumo cuidado para evitar la contaminación en cualquier paso que involucre ADN, especialmente con el ADN de prueba, ya que la contaminación de la muestra con ADN normal sesgará los resultados hacia 1,0, por lo que las anomalías podrían pasar desapercibidas. Se pueden emplear experimentos de FISH, PCR y citometría de flujo para confirmar los resultados. ^{[ 4 ] [ 12 ]}

La CGH en microarrays se basa en el mismo principio que la CGH convencional. En ambas técnicas, el ADN de una muestra de referencia (o control) y el ADN de una muestra de prueba (o paciente) se marcan diferencialmente con dos fluoróforos diferentes y se utilizan como sondas que se cohibridan competitivamente en dianas de ácidos nucleicos . En la CGH convencional, la diana es una metafase de referencia. En la CGH en microarrays, estas dianas pueden ser fragmentos genómicos clonados en diversos vectores (como BAC o plásmidos ), ADNc u oligonucleótidos . ^{[ 17 ]}

Figura 2. ^{[ 14 ]} es una descripción esquemática de la técnica de array CGH. El ADN de la muestra a analizar se marca con un fluoróforo rojo ( cianina 5) y una muestra de ADN de referencia se marca con un fluoróforo verde (cianina 3). Se mezclan cantidades iguales de las dos muestras de ADN y se cohibridan en un microarreglo de ADN de varios miles de fragmentos de ADN clonados u oligonucleótidos espaciados uniformemente, que se han depositado por triplicado en el array. Después de la hibridación, se utilizan sistemas de imágenes digitales para capturar y cuantificar las intensidades de fluorescencia relativas de cada uno de los fluoróforos hibridados. ^{[ 17 ]} La relación resultante de las intensidades de fluorescencia es proporcional a la relación de los números de copias de secuencias de ADN en los genomas de prueba y de referencia. Si las intensidades de los fluorocromos son iguales en una sonda, esta región del genoma del paciente se interpreta como que tiene la misma cantidad de ADN en las muestras de prueba y de referencia; Si hay una relación Cy3:Cy5 alterada, esto indica una pérdida o una ganancia del ADN del paciente en esa región genómica específica. ^{[ 18 ]}

La CGH de matrices se ha implementado utilizando una amplia variedad de técnicas. Por lo tanto, algunas de las ventajas y limitaciones de la CGH de matrices dependen de la técnica elegida. Los enfoques iniciales utilizaron matrices producidas a partir de clones de ADN genómico de inserción grande, como los BAC . El uso de BAC proporciona señales suficientemente intensas para detectar cambios de copia única y localizar con precisión los límites de las aberraciones. Sin embargo, los rendimientos iniciales de ADN de los clones BAC aislados son bajos y se requieren técnicas de amplificación de ADN. Estas técnicas incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por ligación , la PCR con cebadores degenerados utilizando uno o varios conjuntos de cebadores y la amplificación por círculo rodante . ^{[ 19 ]} Las matrices también se pueden construir utilizando ADNc. Estas matrices actualmente producen una alta resolución espacial, pero el número de ADNc está limitado por los genes que se codifican en los cromosomas, y su sensibilidad es baja debido a la hibridación cruzada. ^{[ 14 ]} Esto resulta en la incapacidad de detectar cambios de copia única a escala de todo el genoma. ^{[ 20 ]} El enfoque más reciente consiste en identificar los microarrays con oligonucleótidos cortos. La cantidad de oligonucleótidos es prácticamente infinita, y el procesamiento es rápido, económico y sencillo. Si bien los oligonucleótidos no tienen la sensibilidad suficiente para detectar cambios de una sola copia, el promedio de las proporciones de los oligonucleótidos que se mapean uno al lado del otro en el cromosoma puede compensar la sensibilidad reducida. ^{[ 21 ]} También es posible utilizar microarrays con sondas superpuestas para descubrir puntos de ruptura específicos.

Existen dos enfoques para el diseño de microarrays para aplicaciones de CGH: genoma completo y dirigido.

Los microarrays de genoma completo están diseñados para cubrir todo el genoma humano. Suelen incluir clones que proporcionan una cobertura extensa a lo largo del genoma, así como microarrays con cobertura contigua, dentro de los límites del genoma. Estos microarrays se han desarrollado principalmente para aplicaciones de investigación y han demostrado su gran utilidad en el descubrimiento de genes. También son muy valiosos para el análisis del genoma en busca de ganancias y pérdidas de ADN con una resolución sin precedentes. ^{[ 17 ]}

Los microarrays dirigidos se diseñan para una o varias regiones específicas del genoma con el fin de evaluar ese segmento en particular. Pueden diseñarse para estudiar un cromosoma o segmento cromosómico específico, o para identificar y evaluar anomalías específicas en la dosis de ADN en individuos con sospecha de síndromes de microdeleción o reordenamientos subteloméricos. El objetivo fundamental de un microarray dirigido en la práctica médica es proporcionar resultados clínicamente útiles para el diagnóstico, el asesoramiento genético, el pronóstico y el manejo clínico de anomalías citogenéticas desequilibradas. ^{[ 17 ]}

La CGH convencional se ha utilizado principalmente para la identificación de regiones cromosómicas que se pierden o ganan recurrentemente en tumores, así como para el diagnóstico y pronóstico del cáncer. ^{[ 22 ]} Este enfoque también puede utilizarse para estudiar aberraciones cromosómicas en genomas fetales y neonatales . Además, la CGH convencional puede utilizarse para detectar anomalías cromosómicas y ha demostrado ser eficaz en el diagnóstico de anomalías complejas asociadas con trastornos genéticos humanos. ^{[ 14 ]}

Las aplicaciones de array CGH se centran principalmente en la detección de anomalías genómicas en el cáncer. Sin embargo, el array CGH también es adecuado para el análisis de aberraciones en el número de copias de ADN que causan trastornos genéticos humanos. ^{[ 14 ]} Es decir, el array CGH se emplea para descubrir deleciones, amplificaciones, puntos de ruptura y anomalías de ploidía. Un diagnóstico precoz beneficia al paciente, ya que puede recibir los tratamientos y el asesoramiento adecuados para mejorar su pronóstico. ^{[ 10 ]}