Experimento de Avery-MacLeod-McCarty

El experimento Avery-MacLeod-McCarty fue una demostración experimental realizada por Oswald Avery , Colin MacLeod y Maclyn McCarty que, en 1944, informó que el ADN es la sustancia que causa la transformación bacteriana , en una época en la que se creía ampliamente que eran las proteínas las que cumplían la función de transportar la información genética (de hecho, la palabra proteína se acuñó para indicar la creencia de que su función era primaria ). Fue la culminación de la investigación realizada en la década de 1930 y principios del siglo XX en el Instituto Rockefeller de Investigación Médica para purificar y caracterizar el "principio transformador" responsable del fenómeno de transformación descrito por primera vez en el experimento de Griffith de 1928: Streptococcus pneumoniae muerto de la cepa virulenta tipo III-S, cuando se inyectó junto con neumococos vivos pero no virulentos de tipo II-R, resultó en una infección mortal de neumococos de tipo III-S. En su artículo « Estudios sobre la naturaleza química de la sustancia que induce la transformación de los tipos de neumococo: Inducción de la transformación por una fracción de ácido desoxirribonucleico aislada del neumococo tipo III », publicado en el número de febrero de 1944 del Journal of Experimental Medicine , Avery y sus colegas sugieren que el ADN, en lugar de las proteínas como se creía ampliamente en ese momento, podría ser el material hereditario de las bacterias, y podría ser análogo a los genes y/o virus en organismos superiores. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

Con el desarrollo de la tipificación serológica , los investigadores médicos pudieron clasificar las bacterias en diferentes cepas o tipos . Cuando una persona o un animal de prueba (por ejemplo, un ratón ) se inocula con un tipo particular, se produce una respuesta inmunitaria que genera anticuerpos que reaccionan específicamente con los antígenos de las bacterias. El suero sanguíneo que contiene los anticuerpos se puede extraer y aplicar a cultivos bacterianos . Los anticuerpos reaccionarán con otras bacterias del mismo tipo que la inoculación original. Fred Neufeld , un bacteriólogo alemán, descubrió los tipos de neumococo y la tipificación serológica; hasta los estudios de Frederick Griffith , los bacteriólogos creían que los tipos eran fijos e inmutables de una generación a otra. ^{[ 3 ]}

El experimento de Griffith , publicado en 1928, ^{[ 4 ]} identificó que un "principio transformador" en las bacterias neumocócicas podía transformarlas de un tipo a otro. Griffith, un médico británico, había dedicado años a aplicar la tipificación serológica a casos de neumonía , una enfermedad frecuentemente mortal a principios del siglo XX. Descubrió que a menudo se presentaban múltiples tipos —algunos virulentos y otros no virulentos— durante el curso de un caso clínico de neumonía, y pensó que un tipo podría transformarse en otro (en lugar de que simplemente existieran múltiples tipos desde el principio). Al probar esta posibilidad, descubrió que la transformación podía ocurrir cuando se inyectaban en ratones bacterias muertas de un tipo virulento y bacterias vivas de un tipo no virulento: los ratones desarrollaban una infección mortal (normalmente solo causada por bacterias vivas del tipo virulento) y morían, y se podían aislar bacterias virulentas de dichos ratones infectados. ^{[ 5 ]}

Los resultados del experimento de Griffith pronto fueron confirmados, primero por Fred Neufeld ^{[ 6 ]} en el Instituto Koch y por Martin Henry Dawson en el Instituto Rockefeller. ^{[ 7 ]} Una serie de investigadores del Instituto Rockefeller continuaron estudiando la transformación en los años siguientes. Con Richard HP Sia, Dawson desarrolló un método para transformar bacterias in vitro (en lugar de in vivo como lo había hecho Griffith). ^{[ 8 ]} Después de la partida de Dawson en 1930, James Alloway retomó el intento de extender los hallazgos de Griffith, lo que resultó en la extracción de soluciones acuosas del principio transformador en 1933. Colin MacLeod trabajó para purificar dichas soluciones de 1934 a 1937, y el trabajo fue continuado en 1940 y completado por Maclyn McCarty. ^{[ 9 ] [ 10 ]}

El neumococo se caracteriza por colonias lisas que poseen una cápsula de polisacáridos que induce la formación de anticuerpos ; los diferentes tipos se clasifican según su especificidad inmunológica. ^{[ 1 ]}

El procedimiento de purificación que Avery llevó a cabo consistió en eliminar primero las bacterias con calor y extraer los componentes solubles en solución salina . A continuación, se precipitó la proteína con cloroformo y se hidrolizaron las cápsulas de polisacáridos con una enzima . Se utilizó una precipitación inmunológica mediante anticuerpos específicos para verificar la destrucción completa de las cápsulas. Posteriormente, se precipitó la porción activa mediante fraccionamiento con alcohol , obteniéndose filamentos fibrosos que podían eliminarse con una varilla de agitación. ^{[ 1 ]}

El análisis químico mostró que las proporciones de carbono, hidrógeno, nitrógeno y fósforo en esta porción activa eran consistentes con la composición química del ADN. Para demostrar que era el ADN, y no una pequeña cantidad de ARN , proteína u otro componente celular, el responsable de la transformación, Avery y sus colegas utilizaron varias pruebas bioquímicas. Descubrieron que la tripsina , la quimotripsina y la ribonucleasa (enzimas que degradan proteínas o ARN) no lo afectaban, pero una preparación enzimática de "desoxirribonucleodepolimerasa" (una preparación cruda, obtenible de diversas fuentes animales, que podía degradar el ADN) destruía el poder transformador del extracto. ^{[ 1 ]}

El trabajo posterior en respuesta a las críticas y los desafíos incluyó la purificación y cristalización, por Moses Kunitz en 1948, de una ADN despolimerasa ( desoxirribonucleasa I ), y el trabajo preciso de Rollin Hotchkiss que demostró que prácticamente todo el nitrógeno detectado en el ADN purificado provenía de la glicina , un producto de degradación de la base nucleotídica adenina , y que la contaminación proteica no detectada era como máximo del 0,02% según la estimación de Hotchkiss. ^{[ 11 ] [ 12 ]}

Los hallazgos experimentales del experimento de Avery-MacLeod-McCarty se confirmaron rápidamente y se extendieron a otras características hereditarias además de las cápsulas de polisacáridos. Sin embargo, hubo una considerable reticencia a aceptar la conclusión de que el ADN era el material genético. Según la influyente " hipótesis del tetranucleótido " de Phoebus Levene , el ADN consistía en unidades repetitivas de las cuatro bases nucleotídicas y tenía poca especificidad biológica. Por lo tanto, se pensaba que el ADN era el componente estructural de los cromosomas , mientras que se creía que los genes probablemente estaban hechos del componente proteico de los cromosomas. ^{[ 13 ] [ 14 ]} Esta línea de pensamiento se vio reforzada por la cristalización del virus del mosaico del tabaco en 1935 por Wendell Stanley , ^{[ 15 ]} y los paralelismos entre virus, genes y enzimas; muchos biólogos pensaban que los genes podrían ser una especie de "superenzima", y se demostró que los virus, según Stanley, eran proteínas y compartían la propiedad de la autocatálisis con muchas enzimas. ^{[ 16 ]} Además, pocos biólogos creían que la genética pudiera aplicarse a las bacterias, ya que carecían de cromosomas y reproducción sexual . En particular, muchos de los genetistas conocidos informalmente como el grupo de los fagos , que se volvería influyente en la nueva disciplina de la biología molecular en la década de 1950, descartaban el ADN como material genético (y se inclinaban a evitar los enfoques bioquímicos "complicados" de Avery y sus colegas). Algunos biólogos, incluido Alfred Mirsky , también miembro del Instituto Rockefeller, cuestionaron el hallazgo de Avery de que el principio transformador era ADN puro, sugiriendo que los contaminantes proteicos eran los responsables. ^{[ 13 ] [ 14 ]} Aunque la transformación ocurrió en algunos tipos de bacterias, no pudo replicarse en otras bacterias (ni en ningún organismo superior), y su importancia parecía limitarse principalmente a la medicina. ^{[ 13 ] [ 17 ]}

Los científicos que analizan el experimento de Avery, MacLeod y McCarty discrepan sobre su verdadera influencia en las décadas de 1940 y principios de 1950. Gunther Stent sugirió que fue ignorado en gran medida y que solo se celebró posteriormente , de forma similar al trabajo de Gregor Mendel décadas antes del auge de la genética . Otros, como Joshua Lederberg y Leslie C. Dunn , dan fe de su importancia inicial y citan el experimento como el comienzo de la genética molecular . ^{[ 18 ]}

Algunos microbiólogos y genetistas ya se habían interesado por la naturaleza física y química de los genes antes de 1944, pero el experimento de Avery, MacLeod y McCarty reavivó y amplió el interés por el tema. Si bien la publicación original no mencionaba la genética específicamente, tanto Avery como muchos de los genetistas que leyeron el artículo eran conscientes de las implicaciones genéticas : que Avery podría haber aislado el gen en sí mismo como ADN puro. El bioquímico Erwin Chargaff , el genetista H.J. Muller y otros elogiaron el resultado por establecer la especificidad biológica del ADN y por tener importantes implicaciones para la genética si el ADN desempeñaba un papel similar en organismos superiores. En 1945, la Royal Society otorgó a Avery la Medalla Copley , en parte por su trabajo sobre la transformación bacteriana. ^{[ 19 ]}

Entre 1944 y 1954, el artículo fue citado al menos 239 veces (con citas distribuidas uniformemente a lo largo de esos años), principalmente en artículos sobre microbiología, inmunoquímica y bioquímica. Además del trabajo de seguimiento de McCarty y otros en el Instituto Rockefeller en respuesta a las críticas de Mirsky, el experimento impulsó un trabajo considerable en microbiología, donde arrojó nueva luz sobre las analogías entre la herencia bacteriana y la genética de los organismos de reproducción sexual. ^{[ 17 ]} El microbiólogo francés André Boivin afirmó extender los hallazgos de Avery sobre la transformación bacteriana a Escherichia coli , ^{[ 20 ]} aunque esto no pudo ser confirmado por otros investigadores. ^{[ 17 ]} Sin embargo, en 1946, Joshua Lederberg y Edward Tatum demostraron la conjugación bacteriana en E. coli y mostraron que la genética podía aplicarse a las bacterias, incluso si el método específico de transformación de Avery no era general. ^{[ 21 ]} El trabajo de Avery también motivó a Maurice Wilkins a continuar los estudios cristalográficos de rayos X del ADN, incluso cuando enfrentaba presión de los financiadores para que centrara su investigación en células completas, en lugar de biomoléculas. ^{[ 17 ]}

A pesar del elevado número de citas del artículo y las respuestas positivas que recibió en los años posteriores a su publicación, el trabajo de Avery fue en gran medida ignorado por gran parte de la comunidad científica. Aunque fue bien recibido por muchos científicos, el experimento no afectó seriamente la investigación genética convencional, en parte porque tuvo poca repercusión en los experimentos de genética clásica, en los que los genes se definían por su comportamiento en experimentos de reproducción en lugar de por su composición química. H. J. Muller, si bien estaba interesado, se centró más en estudios físicos que químicos del gen, al igual que la mayoría de los miembros del grupo de los fagos . El trabajo de Avery también fue ignorado por la Fundación Nobel , que posteriormente expresó públicamente su pesar por no haberle otorgado el Premio Nobel . ^{[ 22 ]}

Para la época del experimento de Hershey-Chase de 1952 , los genetistas estaban más inclinados a considerar el ADN como el material genético, y Alfred Hershey era un miembro influyente del grupo de fagos. ^{[ 23 ] [ 24 ]} Erwin Chargaff había demostrado que la composición de bases del ADN varía según la especie (contrariamente a la hipótesis del tetranucleótido), ^{[ 25 ]} y en 1952 Rollin Hotchkiss publicó su evidencia experimental que confirmaba el trabajo de Chargaff y demostraba la ausencia de proteína en el principio transformador de Avery. ^{[ 26 ]} Además, el campo de la genética bacteriana se estaba estableciendo rápidamente, y los biólogos estaban más inclinados a pensar en la herencia en los mismos términos para bacterias y organismos superiores. ^{[ 23 ] [ 24 ]} Después de que Hershey y Chase usaran isótopos radiactivos para demostrar que era principalmente ADN, en lugar de proteína, lo que entraba en las bacterias tras la infección con bacteriófagos , ^{[ 27 ]} pronto se aceptó ampliamente que el ADN era el material. A pesar de los resultados experimentales mucho menos precisos (encontraron una cantidad considerable de proteína que entraba en las células junto con el ADN), el experimento de Hershey-Chase no fue sometido al mismo grado de cuestionamiento. Su influencia se vio impulsada por la creciente red del grupo de fagos y, al año siguiente, por la publicidad en torno a la estructura del ADN propuesta por Watson y Crick (Watson también era miembro del grupo de fagos). Sin embargo, solo en retrospectiva, ambos experimentos demostraron de forma definitiva que el ADN es el material genético. ^{[ 23 ] [ 24 ]}

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• Fry, Michael (2016) Experimentos emblemáticos en biología molecular; Elsevier-Academic Press, Estados Unidos, ISBN 9780128020746

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• Stegenga, Jacob (2011). "La caracterización química del gen: vicisitudes de la evaluación de la evidencia" . Historia y filosofía de las ciencias de la vida . 33 (1): 105–127 . PMID 21789957 . 

• Perfiles en la ciencia: La colección Oswald T. Avery