cromosoma circular

El origen de replicación de E. coli , denominado oriC, consta de secuencias de ADN reconocidas por la proteína DnaA , la cual está altamente conservada entre diferentes especies bacterianas . La unión de DnaA al origen inicia el reclutamiento regulado de otras enzimas y proteínas que, finalmente, conducen al establecimiento de dos replisomas completos para la replicación bidireccional. ^{[ 1 ]}

Los elementos de la secuencia de ADN dentro de oriC que son importantes para su función incluyen las cajas DnaA, una repetición de 9 nucleótidos con una secuencia consenso altamente conservada 5' – TTATCCACA – 3', ^{[ 2 ]} que son reconocidas por la proteína DnaA. La proteína DnaA desempeña un papel crucial en el inicio de la replicación del ADN cromosómico. ^{[ 3 ]} Unida a ATP, y con la ayuda de proteínas similares a las histonas bacterianas [HU], DnaA desenrolla una región rica en AT cerca del límite izquierdo de oriC , que contiene tres motivos de 13 nucleótidos, ^{[ 4 ]} y abre el ADN de doble cadena para la entrada de otras proteínas de replicación. ^{[ 5 ]}

Esta región también contiene cuatro secuencias de elementos de desenrollamiento de ADN "GATC" que son reconocidas por la ADN adenina metilasa (Dam), una enzima que modifica la base adenina cuando esta secuencia no está metilada o está hemimetilada. La metilación de las adeninas es importante ya que altera la conformación del ADN para promover la separación de las hebras, ^{[ 6 ]} y parece que esta región de ori C tiene una tendencia natural a desenrollarse. ^{[ 7 ]}

Luego, DnaA recluta la helicasa replicativa DnaB del complejo DnaB-DnaC a la región desenrollada para formar el complejo de precebado. ^{[ 8 ]} Después de que DnaB se transloca al ápice de cada horquilla de replicación, la helicasa desenrolla el ADN parental e interactúa momentáneamente con la primasa . ^{[ 9 ]}

Para que la replicación del ADN continúe, se necesitan proteínas de unión a cadena sencilla que impidan que las cadenas de ADN formen estructuras secundarias y que se vuelvan a unir . Además, se necesita la ADN girasa para aliviar la tensión topológica generada por la acción de la helicasa DnaB.

Cuando la horquilla de replicación gira alrededor del círculo, se forma una estructura con forma de la letra griega theta ( θ). John Cairns demostró la estructura theta de la replicación cromosómica de E. coli en 1963, utilizando un método innovador para visualizar la replicación del ADN. En su experimento, marcó radiactivamente el cromosoma cultivando sus cultivos en un medio que contenía timidina tritiada (³H- timidina ). La base nucleosídica se incorporó uniformemente al cromosoma bacteriano. Luego, aisló los cromosomas mediante lisis suave de las células y los colocó en una rejilla de micrografía electrónica (ME) que expuso a una película de rayos X durante dos meses. Este experimento demuestra claramente el modelo de replicación theta de los cromosomas bacterianos circulares. ^{[ 10 ]}

• Ver autorradiografía de un cromosoma intacto en replicación de E. coli.

Como se describió anteriormente, la replicación cromosómica bacteriana ocurre de forma bidireccional. Esto se demostró por primera vez mediante el marcaje específico de cromosomas bacterianos en replicación con isótopos radiactivos . Las regiones de ADN que se replicaban durante el experimento se visualizaron mediante autorradiografía y el examen microscópico de la película revelada. Esto permitió a los investigadores observar dónde se producía la replicación. Las primeras observaciones concluyentes de replicación bidireccional provinieron de estudios con B. subtilis. ^{[ 11 ]} Poco después, también se demostró que el cromosoma de E. coli se replicaba bidireccionalmente. ^{[ 12 ]}

• Véase la Figura 4 de DM Prescott y PL Kuempel (1972): Una pista de grano producida por un cromosoma de E. coli a partir de células marcadas durante 19 min con [3H] timina, seguida de un marcaje durante 2,5 min con [3H]timina y ['H]timidina..

La holoenzima ADN polimerasa III de E. coli es un complejo de 900 kD, que posee una estructura esencialmente dimérica . Cada unidad monomérica tiene un núcleo catalítico, una subunidad de dimerización y un componente de procesividad . ^{[ 13 ]} La ADN Pol III utiliza un conjunto de sus subunidades centrales para sintetizar la cadena conductora de forma continua, mientras que el otro conjunto de subunidades centrales cicla de un fragmento de Okazaki al siguiente en la cadena rezagada en bucle. La síntesis de la cadena conductora comienza con la síntesis de un cebador de ARN corto en el origen de replicación por la enzima primasa ( proteína DnaG ).

Luego, un único dímero de ADN polimerasa III, en un complejo integrado con la helicasa DnaB, agrega desoxinucleótidos a este cebador. La síntesis de la cadena conductora procede entonces de forma continua, mientras que el ADN se desenrolla simultáneamente en la horquilla de replicación. En contraste, la síntesis de la cadena rezagada se lleva a cabo en fragmentos cortos de Okazaki. Primero, la primasa sintetiza un cebador de ARN y, como en la síntesis de la cadena conductora, la ADN Pol III se une al cebador de ARN y agrega desoxirribonucleótidos .

Cuando se completa la síntesis de un fragmento de Okazaki, la replicación se detiene y las subunidades centrales de la ADN Pol III se disocian de la pinza deslizante β [la pinza deslizante B es la subunidad de procesividad de la ADN Pol III]. ^{[ 14 ]} El cebador de ARN se elimina y se reemplaza con ADN por la ADN polimerasa I [que también posee actividad exonucleasa de corrección de pruebas ] y la muesca restante se sella por la ADN ligasa , que luego liga estos fragmentos para formar la hebra rezagada.

Una proporción sustancial (10-15%) de las horquillas de replicación que se originan en oriC encuentran un daño en el ADN o una rotura de la cadena cuando las células se cultivan en condiciones normales de laboratorio (sin un tratamiento exógeno que dañe el ADN). ^{[ 15 ]} Los daños en el ADN encontrados son procesados ​​normalmente por enzimas de reparación recombinacional para permitir la progresión continua de la horquilla de replicación. ^{[ 15 ]}

La terminación es el proceso de fusión de las horquillas de replicación y desensamblaje de los replisomas para generar dos moléculas de ADN separadas y completas . Ocurre en la región del término, aproximadamente opuesta a oriC en el cromosoma (Fig. 5). La región del término contiene varios sitios de terminación de la replicación del ADN, o sitios "Ter". Una proteína especial de "terminación de la replicación" debe unirse al sitio Ter para que este detenga la replicación. Cada sitio Ter tiene polaridad de acción, es decir, detendrá una horquilla de replicación que se acerque al sitio Ter desde una dirección, pero permitirá el movimiento sin impedimentos de la horquilla a través del sitio Ter desde la dirección opuesta. La disposición de los sitios Ter forma dos grupos opuestos que obligan a las dos horquillas a encontrarse dentro de la región que abarcan. Esta disposición se denomina "trampa de horquilla de replicación". ^{[ 16 ]}

• Ver ubicaciones y secuencias de los extremos de replicación de E. coli. (A) Mapa que muestra el ori y los 10 sitios Ter. (B) La secuencia consenso de Ter.

Los sitios Ter interactúan específicamente con la proteína terminadora de replicación llamada Tus en E. coli . ^{[ 17 ]} El complejo Tus-Ter impide la actividad de desenrollamiento del ADN de DnaB de manera dependiente de la orientación. ^{[ 18 ]}

• La estructura cristalina del complejo de la proteína Tus-ADN Ter (A) que muestra las caras de Tus que no bloquean y que bloquean la horquilla de replicación. (B) Una vista en sección transversal de la superficie que detiene la helicasa.

La replicación del ADN que separa las horquillas de replicación opuestas da como resultado cromosomas completos unidos en forma de " catenaciones " o círculos topológicamente interconectados. Estos círculos no están unidos covalentemente, sino mecánicamente, ya que se encuentran entrelazados y cada uno está cerrado covalentemente. La separación de los círculos catenados requiere la acción de topoisomerasas (decatenación). En E. coli , la ADN topoisomerasa IV desempeña un papel fundamental en la separación de los cromosomas catenados, rompiendo transitoriamente ambas hebras de ADN de un cromosoma y permitiendo que el otro pase a través de la ruptura.

Ha habido cierta confusión sobre el papel que desempeña la ADN girasa en la descatenación. Para definir la nomenclatura, existen dos tipos de topoisomerasas: el tipo I produce rupturas transitorias de cadena simple en el ADN y el tipo II produce rupturas transitorias de cadena doble. Como resultado, la enzima de tipo I elimina los superenrollamientos del ADN de uno en uno, mientras que la enzima de tipo II los elimina de dos en dos. La topo I tanto de procariotas como de eucariotas es la topoisomerasa de tipo I. La topo II eucariota, la girasa bacteriana y la topo IV bacteriana pertenecen al tipo II.

La ADN girasa también posee actividad de topoisomerasa tipo II; por lo tanto, al ser un homólogo de la topoisomerasa IV (que también posee actividad de topoisomerasa II), se espera similitud en las funciones de ambas proteínas. La función preliminar de la ADN girasa es introducir superenrollamientos negativos en el ADN, relajando así los superenrollamientos positivos que se forman durante la replicación del ADN. La topoisomerasa IV también relaja los superenrollamientos positivos; por consiguiente, la ADN girasa y la topoisomerasa IV desempeñan una función casi idéntica al eliminar los superenrollamientos positivos que se encuentran delante de una ADN polimerasa en translocación, lo que permite que la replicación del ADN continúe sin obstáculos por la tensión topológica. ^{[ 19 ]}

La ADN girasa no es la única enzima responsable de la descatenación. En un experimento realizado por Zechiedrich , Khodursky y Cozzarelli en 1997, se descubrió que la topoisomerasa IV es la única descatenasa importante de los intermediarios de la replicación del ADN en bacterias. ^{[ 20 ]} Cuando se inhibió únicamente la ADN girasa, la mayoría de los catenanos se desvincularon. Sin embargo, cuando se inhibió únicamente la topoisomerasa IV, la descatenación se bloqueó casi por completo. Esto sugiere que la topoisomerasa IV es la proteína principal para la descatenación de cromosomas interconectados in vivo , con la ADN girasa desempeñando un papel secundario.