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Dispersión biológica de ángulo pequeño

Representación esquemática de un experimento SAS: las curvas de dispersión de la solución dan lugar a estructuras aproximadas, en las que se pueden ajustar modelos más finos par...

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Representación esquemática de un experimento SAS: las curvas de dispersión de la solución dan lugar a estructuras aproximadas, en las que se pueden ajustar modelos más finos para revelar detalles en el conjunto.
Cobertura del rango de resolución mediante SAXS en comparación con otras técnicas para la determinación de estructuras.

La dispersión biológica de ángulo pequeño es un método de dispersión de ángulo pequeño para el análisis de la estructura de materiales biológicos. La dispersión de ángulo pequeño se utiliza para estudiar la estructura de una variedad de objetos como soluciones de macromoléculas biológicas, nanocompuestos, aleaciones y polímeros sintéticos. [ 1 ] La dispersión de rayos X de ángulo pequeño ( SAXS ) y la dispersión de neutrones de ángulo pequeño ( SANS ) son las dos técnicas complementarias conocidas conjuntamente como dispersión de ángulo pequeño (SAS). [ 2 ] SAS es un método análogo a la difracción de rayos X y neutrones , la dispersión de rayos X de ángulo amplio , así como a la dispersión de luz estática . A diferencia de otros métodos de dispersión de rayos X y neutrones, SAS proporciona información sobre los tamaños y formas de partículas tanto cristalinas como no cristalinas. Cuando se utiliza para estudiar materiales biológicos, que muy a menudo se encuentran en solución acuosa, el patrón de dispersión se promedia en orientación. [ 3 ] [ 4 ]

Los patrones SAS se obtienen con ángulos pequeños de unos pocos grados. SAS permite obtener información estructural con una resolución de entre 1 y 25 nm , y distancias de repetición en sistemas parcialmente ordenados de hasta 150  nm. La dispersión de ángulo ultrapequeño (USAS) permite resolver dimensiones aún mayores. La dispersión de ángulo pequeño con incidencia rasante (GISAS) es una técnica potente para el estudio de capas de moléculas biológicas sobre superficies.

En aplicaciones biológicas, la espectroscopia de absorción de rayos X de ángulo pequeño (SAS) se utiliza para determinar la estructura de una partícula en términos de tamaño y forma promedio. También permite obtener información sobre la relación superficie - volumen . Generalmente, las macromoléculas biológicas se dispersan en un líquido. El método es preciso, en su mayoría no destructivo y suele requerir una preparación mínima de la muestra. Sin embargo, las moléculas biológicas son siempre susceptibles al daño por radiación .

En comparación con otros métodos de determinación de estructura, como la RMN en solución o la cristalografía de rayos X , la SAS permite superar algunas limitaciones. Por ejemplo, la RMN en solución está limitada al tamaño de las proteínas, mientras que la SAS puede utilizarse tanto para moléculas pequeñas como para grandes ensamblajes multimoleculares. La RMN de estado sólido sigue siendo una herramienta indispensable para determinar información a nivel atómico de macromoléculas mayores de 40 kDa o muestras no cristalinas como las fibrillas amiloides. La determinación de la estructura mediante cristalografía de rayos X puede llevar varias semanas o incluso años, mientras que las mediciones de SAS se realizan en días. La SAS también puede acoplarse a otras técnicas analíticas como la cromatografía de exclusión por tamaño para estudiar muestras heterogéneas. [ 5 ] Sin embargo, con la SAS no es posible medir las posiciones de los átomos dentro de la molécula.

Método

Curvas de dispersión de rayos X en solución calculadas a partir de modelos atómicos de veinticinco proteínas diferentes con masas moleculares entre 10 y 300 kDa.

Conceptualmente, los experimentos de dispersión de rayos X a ángulo pequeño son sencillos: la muestra se expone a rayos X o neutrones y la radiación dispersada se registra mediante un detector. Dado que las mediciones de SAXS se realizan muy cerca del haz primario ("ángulos pequeños"), la técnica requiere un haz de rayos X o neutrones altamente colimado o enfocado . La dispersión biológica de rayos X a ángulo pequeño se realiza a menudo en fuentes de radiación sincrotrón , ya que las moléculas biológicas normalmente dispersan débilmente y las soluciones medidas son diluidas . El método SAXS biológico se beneficia de la alta intensidad de los haces de fotones de rayos X proporcionados por los anillos de almacenamiento del sincrotrón . La curva de dispersión de rayos X o neutrones ( intensidad frente al ángulo de dispersión ) se utiliza para crear un modelo de baja resolución de una proteína, que se muestra aquí en la imagen de la derecha. Además, se pueden utilizar los datos de dispersión de rayos X o neutrones y ajustar dominios separados (estructuras de rayos X o RMN ) en la "envolvente SAXS".

En un experimento de dispersión, una solución de macromoléculas se expone a rayos X (con una longitud de onda λ típicamente alrededor de 0,15  nm) o neutrones térmicos ( λ ≈ 0,5  nm). La intensidad dispersada I(s) se registra como una función de la transferencia de momento s ( s = 4πsinθ/λ , donde 2θ es el ángulo entre la radiación incidente y la dispersada). De la intensidad de la solución se resta la dispersión debida únicamente al disolvente. Las posiciones y orientaciones aleatorias de las partículas dan como resultado una distribución de intensidad isotrópica que, para partículas monodispersas no interactuantes, es proporcional a la dispersión de una sola partícula promediada sobre todas las orientaciones. La dispersión neta de partículas es proporcional a la diferencia al cuadrado en la densidad de longitud de dispersión ( densidad electrónica para rayos X y densidad nuclear/de espín para neutrones) entre la partícula y el disolvente, el llamado contraste. El contraste se puede variar en la dispersión de neutrones usando mezclas de H₂O / D₂O o deuteración selectiva para obtener información adicional. [ 1 ] El contenido de información de los datos SAS se ilustra aquí en la figura de la derecha, que muestra patrones de dispersión de rayos X de proteínas con diferentes plegamientos y masas moleculares . En ángulos bajos (resolución de 2-3  nm) las curvas son funciones de decaimiento rápido de s esencialmente determinadas por la forma de la partícula, que difieren claramente. En resolución media (2 a 0,5  nm) las diferencias ya son menos pronunciadas y por encima de  la resolución de 0,5 nm todas las curvas son muy similares. [ 6 ] SAS contiene así información sobre las características estructurales generales – forma, estructura cuaternaria y terciaria – pero no es adecuado para el análisis de la estructura atómica.

Historia

Las primeras aplicaciones se remontan a finales de la década de 1930, cuando Guinier desarrolló los principios fundamentales de la SAXS en su trabajo sobre aleaciones metálicas. En la primera monografía sobre SAXS, escrita por Guinier y Fournet, ya se demostró que el método proporciona información no solo sobre el tamaño y la forma de las partículas, sino también sobre la estructura interna de sistemas desordenados y parcialmente ordenados.

En la década de 1960, este método adquirió una importancia creciente en el estudio de macromoléculas biológicas en solución, ya que permitía obtener información estructural de baja resolución sobre la forma general y la estructura interna en ausencia de cristales. Un avance significativo en los experimentos de SAXS y SANS se produjo en la década de 1970, gracias a la disponibilidad de radiación sincrotrón y fuentes de neutrones. Estas últimas allanaron el camino para la variación del contraste mediante el intercambio de disolventes de H₂O por D₂O y métodos de deuteración específicos. Se comprendió que los estudios de dispersión en solución proporcionan, con una inversión mínima de tiempo y esfuerzo, información útil sobre la estructura de sistemas bioquímicos no cristalinos. Además, SAXS/SANS también posibilitó investigaciones en tiempo real de interacciones intermoleculares, incluyendo el ensamblaje y los cambios conformacionales a gran escala en ensamblajes macromoleculares .

La principal dificultad de la espectroscopia de absorción de rayos X (SAS) como método estructural radica en extraer la información estructural tridimensional del objeto a partir de datos experimentales unidimensionales. Anteriormente, solo se determinaban directamente los parámetros generales de las partículas (por ejemplo, volumen, radio de giro) de las macromoléculas a partir de los datos experimentales, mientras que el análisis en términos de modelos tridimensionales se limitaba a cuerpos geométricos simples (por ejemplo, elipsoides, cilindros, etc.) o se realizaba mediante un método de ensayo y error ad hoc. La microscopía electrónica se utilizaba a menudo como restricción para la construcción de modelos de consenso. En la década de 1980, el progreso en otros métodos estructurales provocó una disminución del interés de los bioquímicos en los estudios de SAS, que extraían conclusiones estructurales a partir de solo un par de parámetros generales o se basaban en modelos de ensayo y error.

La década de 1990 trajo consigo un avance significativo en los métodos de análisis de datos SAXS/SANS, lo que abrió el camino para el modelado ab initio fiable de complejos macromoleculares, incluyendo la determinación detallada de la forma y la estructura de dominios, así como la aplicación de técnicas de refinamiento de cuerpo rígido. Este progreso estuvo acompañado de nuevos avances en la instrumentación, lo que permitió alcanzar resoluciones temporales submilimétricas en fuentes SR de tercera generación en los estudios de plegamiento de proteínas y ácidos nucleicos. [ 1 ]

En 2005, se inició un proyecto de cuatro años, denominado Iniciativa de Dispersión de Rayos X de Ángulo Pequeño para Europa ( SAXIER ) , con el objetivo de combinar los métodos SAXS con otras técnicas analíticas y crear software automatizado para analizar rápidamente grandes cantidades de datos. El proyecto creó una infraestructura SAXS europea unificada, utilizando los métodos más avanzados disponibles. [ 7 ]

Análisis de datos

En un experimento SAS de buena calidad, se miden varias soluciones con diferentes concentraciones de la macromolécula en estudio. Al extrapolar las curvas de dispersión medidas a concentraciones variables hasta concentración cero, se obtiene una curva de dispersión que representa una dilución infinita. En ese caso, los efectos de la concentración no deberían afectar la curva de dispersión. El análisis de datos de la curva de dispersión extrapolada comienza con la inspección del inicio de la curva de dispersión en la región alrededor de s = 0. Si la región sigue la aproximación de Guinier (también conocida como ley de Guinier ), la muestra no está agregada . Entonces, la forma de la partícula en cuestión se puede determinar mediante varios métodos, algunos de los cuales se describen en la siguiente referencia. [ 1 ]

Transformada de Fourier indirecta

El primer paso suele ser calcular la transformada de Fourier de la curva de dispersión. La curva transformada puede interpretarse como la función de distribución de distancias dentro de una partícula. Esta transformación también ofrece la ventaja de regularizar los datos de entrada.

Modelos de baja resolución

Modelos de lisozima construidos mediante diferentes métodos. Izquierda: forma general reconstruida por SASHA ; centro: modelo de residuo ficticio, construido por DAMMIN ; DAMMIF ; derecha: modelo GASBOR compatible con la cadena.

El análisis SAS puede realizarse cuando no se dispone de información sobre la estructura terciaria. En consecuencia, se requiere un método ab initio para determinar la forma aproximada de la molécula (o multímero) en cuestión (o para evitar suposiciones indebidas). En el EMBL se han desarrollado intensamente numerosos programas informáticos de análisis SAS de libre acceso . Una diferencia clave radica en cómo eligen modelar la molécula y, por lo tanto, estructurar el espacio de hipótesis.

Armónicos esféricos
SASHA ( Small Angle Scattering Shape Determination ) modela la partícula como una envolvente angular r=F(ω) , donde ( r,ω ) son coordenadas esféricas, descritas por una serie de armónicos esféricos . La forma de baja resolución se define así por unos pocos parámetros —los coeficientes de esta serie— que se ajustan a los datos de dispersión. Se demostró que, bajo ciertas circunstancias, se puede extraer una envolvente única a partir de los datos de dispersión. Este método solo es aplicable a partículas globulares con formas relativamente simples y sin cavidades internas significativas. [ 8 ] [ 9 ]
Cuenta (esferas compactas)
DALAI_GA es un programa elegante que toma una esfera con un diámetro igual al tamaño máximo de partícula Dmax, determinado a partir de los datos de dispersión (mediante armónicos esféricos), y la llena con cuentas. Cada cuenta pertenece a la partícula (índice = 1) o al disolvente (índice = 0). La forma se describe mediante una cadena binaria de longitud M. Partiendo de una cadena aleatoria, un algoritmo genético busca un modelo que se ajuste a los datos. En la búsqueda se imponen restricciones de compacidad y conectividad, implementadas en el programa DAMMIN (1999). [ 10 ]
Una extensión es MONSA (1999), que permite el ajuste simultáneo a múltiples curvas SAS, incluidas las de diferentes tipos (por ejemplo, rayos X y neutrones). Esto aborda el problema de tener que obtener una estructura tridimensional a partir de un patrón de dispersión unidimensional para el análisis de datos SAS. [ 11 ]
Otra extensión es DAMMIF (2009), una reescritura que se ejecuta mucho más rápido (entre 25 y 40 veces) que DAMMIN . El volumen de búsqueda también se puede ampliar libremente. [ 12 ]
Cadena
Un enfoque que utiliza un conjunto de residuos ficticios (DR) y recocido simulado para construir un modelo DR localmente "compatible con la cadena" dentro de una esfera de diámetro Dmax permite extraer más detalles de los datos SAXS. Este método está implementado en el programa GASBOR . [ 13 ] [ 14 ]
El procedimiento de "dar y recibir" SAXS3D y el programa SASMODEL , basados ​​en elipsoides interconectados, son enfoques ab initio de Monte Carlo sin limitación en el espacio de búsqueda. [ 6 ]
Estructura secundaria
En Prior et al. (2020), que no está disponible como programa descargable, se utiliza la estructura secundaria predicha a partir de la secuencia de proteínas para orientar la búsqueda. [ 15 ]

Los datos de SAS no implican una única solución. Por ejemplo, muchas proteínas diferentes pueden tener la misma curva de dispersión. La reconstrucción de la estructura 3D podría dar lugar a un gran número de modelos distintos. Para evitar este problema, es necesario considerar varias simplificaciones.

Modelo de consenso

Los modelos basados ​​en Montecarlo contienen cientos o miles de parámetros, y se requiere precaución para evitar una interpretación excesiva. Un enfoque común consiste en alinear un conjunto de modelos resultantes de ejecuciones independientes de reconstrucción de formas para obtener un modelo promedio que conserve las características más persistentes y, posiblemente, también las más fiables (por ejemplo, utilizando el programa SUPCOMB ). [ 6 ] [ 16 ] [ 17 ]

Agregar bucles faltantes

Los aminoácidos de superficie desordenados (" bucles ") a menudo no se observan en estudios de RMN y cristalográficos , y pueden estar ausentes en los modelos reportados. Dichos elementos desordenados contribuyen a la intensidad de dispersión y sus ubicaciones probables pueden determinarse fijando la parte conocida de la estructura y agregando las partes faltantes para ajustar el patrón SAS de la partícula completa. El enfoque de residuo ficticio se extendió y los algoritmos para agregar bucles o dominios faltantes se implementaron en el paquete de programas CREDO . [ 6 ]

métodos híbridos

Recientemente se propusieron algunos métodos que utilizan datos SAXS como restricciones. Los autores buscaban mejorar los resultados de los métodos de reconocimiento de plegamiento [ 18 ] y predicción de la estructura de proteínas de novo [ 19 ] . Los datos SAXS proporcionan la transformada de Fourier del histograma de distancias de pares atómicos (función de distribución de pares) para una proteína dada. Esto puede servir como una restricción estructural en los métodos utilizados para determinar el plegamiento conformacional nativo de la proteína. El enhebrado o reconocimiento de plegamiento asume que la estructura 3D está más conservada que la secuencia. Por lo tanto, secuencias muy divergentes pueden tener una estructura similar. Los métodos ab initio, por otro lado, abordan uno de los mayores problemas de la biología molecular, a saber, predecir el plegamiento de una proteína "desde cero", utilizando secuencias o estructuras homólogas. Utilizando el "filtro SAXS", los autores lograron purificar significativamente el conjunto de modelos de proteínas de novo [ 19 ] . Esto se demostró además mediante búsquedas de homología estructural . También se demostró que la combinación de puntuaciones SAXS con puntuaciones, utilizadas en métodos de enhebrado, mejora significativamente el rendimiento del reconocimiento de plegamiento. [ 18 ] En un ejemplo se demostró cómo se puede ensamblar la estructura terciaria aproximada de proteínas modulares a partir de estructuras de dominios de RMN de alta resolución, utilizando datos SAXS, restringiendo los grados de libertad traslacionales. [ 20 ] Otro ejemplo muestra cómo se pueden combinar los datos SAXS con RMN, cristalografía de rayos X y microscopía electrónica para reconstruir la estructura cuaternaria de una proteína multidominio. [ 21 ]

Adecuado

Los patrones de dispersión de soluciones de proteínas multidominio y complejos macromoleculares también pueden ajustarse utilizando modelos construidos a partir de estructuras de alta resolución ( RMN , rayos X o predichas mediante, por ejemplo, AlphaFold ) de dominios o subunidades individuales, asumiendo que se conserva su estructura terciaria . Dependiendo de la complejidad del objeto, se emplean diferentes enfoques para la búsqueda global de la configuración óptima de subunidades que se ajuste a los datos experimentales. Algunos programas también pueden tener en cuenta la flexibilidad intradominio. [ 22 ]

Sistemas flexibles

Recientemente se propuso un método elegante para abordar el problema de las proteínas intrínsecamente desordenadas o multidominio con enlaces flexibles . [ 23 ] Este método permite la coexistencia de diferentes conformaciones de una proteína, las cuales contribuyen al patrón de dispersión experimental promedio. Inicialmente, el método de optimización de conjuntos (EOM) genera un conjunto de modelos que cubren el espacio de configuración de la proteína. A continuación, se calcula la curva de dispersión para cada modelo. En el segundo paso, el programa selecciona subconjuntos de modelos de proteínas. Se calcula la dispersión experimental promedio para cada subconjunto y se ajusta a los datos experimentales de SAXS. Si no se encuentra el mejor ajuste, los modelos se reorganizan entre diferentes subconjuntos y se realiza un nuevo cálculo de dispersión promedio y un ajuste a los datos experimentales. Este método se ha probado en dos proteínas: lisozima desnaturalizada y proteína quinasa de Bruton . Se obtuvieron resultados interesantes y prometedores. [ 23 ]

Capas de moléculas biológicas y GISAS

Los recubrimientos de biomoléculas pueden estudiarse con dispersión de rayos X y neutrones de incidencia rasante. IsGISAXS ( dispersión de rayos X de ángulo pequeño de incidencia rasante ) es un programa de software dedicado a la simulación y análisis de GISAXS de nanoestructuras. IsGISAXS solo abarca la dispersión por partículas de tamaño nanométrico, que están enterradas en una matriz subsuperficial o soportadas sobre un sustrato o enterradas en una capa delgada sobre un sustrato. También se maneja el caso de agujeros. La geometría está restringida a un plano de partículas. La sección transversal de dispersión se descompone en términos de función de interferencia y factor de forma de partícula . Se hace hincapié en la geometría de incidencia rasante que induce un "efecto de refracción del haz". El factor de forma de partícula se calcula dentro de la aproximación de Born de onda distorsionada (DWBA), partiendo como un estado no perturbado con interfaces nítidas o con el perfil perpendicular real del índice de refracción . Se dispone de varios tipos de formas geométricas simples con una descripción completa de las distribuciones de tamaño y forma en la Aproximación de Desacoplamiento (AD), en la aproximación monodispersa local (AML) y también en la aproximación de correlación tamaño-espaciado (ASE). Se consideran tanto sistemas desordenados de partículas definidos por su función de correlación de pares partícula-partícula como cristales o paracristales bidimensionales. [ 24 ]

Véase también

Referencias

  1. 1 2 3 4 Svergun DI, Koch MH (2003). "Estudios de dispersión de ángulo pequeño de macromoléculas biológicas en solución". Reports on Progress in Physics . 66 (10): 1735– 82. Bibcode : 2003RPPh...66.1735S . doi : 10.1088/0034-4885/66/10/R05 . S2CID 9305500 . 
  2. ↑ Hamley, IW "Dispersión de ángulo pequeño: teoría, instrumentación, datos y aplicaciones" – Wiley, 2022.
  3. ↑ Jacques, David A.; Trewhella, Jill (1 de abril de 2010). "Dispersión de ángulo pequeño para biología estructural: ampliando la frontera evitando los escollos" . Protein Science . 19 (4): 642– 657. doi : 10.1002/pro.351 . PMC 2867006. PMID 20120026 .  
  4. ↑ Lipfert J, Doniach S (1 de junio de 2007). "Dispersión de rayos X de ángulo pequeño de ARN, proteínas y complejos proteicos". Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure . 36 (1): 307–27 . doi : 10.1146/annurev.biophys.36.040306.132655 . PMID 17284163 . 
  5. ↑ Meisburger SP, Thomas WC, Watkins MB, Ando N (junio de 2017). "Estudios de dispersión de rayos X de la dinámica estructural de las proteínas" . Chemical Reviews . 117 (12): 7615–7672 . doi : 10.1021/acs.chemrev.6b00790 . PMC 5562295. PMID 28558231 .  
  6. 1 2 3 4 Svergun DI, Koch MH (octubre de 2002). "Avances en el análisis de estructuras mediante dispersión de ángulo pequeño en solución". Current Opinion in Structural Biology . 12 (5): 654– 60. doi : 10.1016/S0959-440X(02)00363-9 . PMID 12464319 . 
  7. ↑ "SAXIER: Iniciativa de dispersión de rayos X de ángulo pequeño para Europa" .
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  10. ↑ "DAMMIN: Determinación de la forma ab initio mediante recocido simulado utilizando un modelo de átomo ficticio de fase única" . Grupo de dispersión de ángulo pequeño biológico . EMBL Hamburgo.
  11. ↑ Svergun DI (junio de 1999). "Restauración de la estructura de baja resolución de macromoléculas biológicas a partir de la dispersión en solución mediante recocido simulado" . Biophysical Journal . 76 (6): 2879–86 . Bibcode : 1999BpJ....76.2879S . doi : 10.1016/S0006-3495(99)77443-6 . PMC 1300260. PMID 10354416 .  
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  13. ↑ "GASBOR: Reconstrucción ab initio de una estructura proteica mediante un conjunto de residuos ficticios en forma de cadena" . Grupo de dispersión biológica de ángulo pequeño . EMBL Hamburgo.
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Lecturas adicionales

  • Koch MH, Vachette P, Svergun DI (mayo de 2003). "Dispersión de ángulo pequeño: una perspectiva sobre las propiedades, estructuras y cambios estructurales de macromoléculas biológicas en solución". Quarterly Reviews of Biophysics . 36 (2): 147– 227. Bibcode : 2003QRBio..36..147K . doi : 10.1017/S0033583503003871 . PMID 14686102. S2CID 5432509 .  
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