Química bioortogonal

La azida actúa como un electrófilo blando que prefiere nucleófilos blandos como las fosfinas . Esto contrasta con la mayoría de los nucleófilos biológicos, que suelen ser nucleófilos duros. La reacción se produce selectivamente en condiciones que toleran el agua, generando un producto estable.

Las fosfinas están completamente ausentes en los sistemas vivos y no reducen los enlaces disulfuro a pesar de su leve potencial reductor. Se ha demostrado que las azidas son biocompatibles en fármacos aprobados por la FDA, como la azidotimidina, y en otros usos como agentes de reticulación. Además, su pequeño tamaño permite que se incorporen fácilmente a las biomoléculas a través de las vías metabólicas celulares.

Los reactivos de fosfina se oxidan lentamente por el aire en los sistemas vivos. Además, es probable que sean metabolizados in vitro por las enzimas del citocromo P450 .

La cinética de las reacciones es lenta, con constantes de velocidad de segundo orden de alrededor de 0,0020  M ⁻¹ •s ⁻¹ . Los intentos de aumentar las velocidades de ataque nucleofílico mediante la adición de grupos donadores de electrones a las fosfinas mejoraron la cinética, pero también aumentaron la velocidad de oxidación por el aire.

La cinética deficiente requiere el uso de altas concentraciones de fosfina, lo que genera problemas de alta señal de fondo en aplicaciones de imagen. Se han realizado intentos para combatir el problema del alto fondo mediante el desarrollo de reactivos de fosfina fluorogénicos basados ​​en fluoresceína y luciferina , pero la cinética intrínseca sigue siendo una limitación. ^{[ 16 ]}

La clásica cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre ha demostrado ser una reacción de clic extremadamente rápida y eficaz para la bioconjugación, pero no es apta para su uso en células vivas debido a la toxicidad de los iones Cu(I). Esta toxicidad se debe al daño oxidativo causado por las especies reactivas de oxígeno que generan los catalizadores de cobre. Además, se ha observado que los complejos de cobre inducen cambios en el metabolismo celular y son absorbidos por las células.

Se han desarrollado algunos ligandos para prevenir el daño a las biomoléculas y facilitar su eliminación en aplicaciones in vitro . Sin embargo, se ha descubierto que los diferentes entornos de ligandos de los complejos aún pueden afectar el metabolismo y la absorción, introduciendo una perturbación indeseada en la función celular. ^{[ 17 ]}

El grupo azida es particularmente bioortogonal porque es extremadamente pequeño (favorable para la permeabilidad celular y evita perturbaciones), metabólicamente estable y no existe naturalmente en las células y por lo tanto no tiene reacciones secundarias biológicas competitivas. Aunque las azidas no son el 1,3-dipolo más reactivo disponible para la reacción, se prefieren por su relativa falta de reacciones secundarias y estabilidad en condiciones sintéticas típicas. ^{[ 18 ]} El alquino no es tan pequeño, pero aún tiene la estabilidad y ortogonalidad necesarias para el marcaje in vivo . Los ciclooctinos son tradicionalmente el cicloalquino más común para estudios de marcaje, ya que son el anillo de alquino estable más pequeño.

La reacción transcurre como una cicloadición 1,3-dipolar estándar, un tipo de desplazamiento pericíclico concertado y asíncrono. La naturaleza ambivalente del dipolo 1,3 debería imposibilitar la identificación de un centro electrófilo o nucleófilo en la azida, de modo que la dirección del flujo electrónico cíclico carece de sentido. [p] Sin embargo, los cálculos han demostrado que la distribución electrónica entre los nitrógenos hace que el átomo de nitrógeno más interno tenga la mayor carga negativa. ^{[ 19 ]}

Si bien la reacción produce una mezcla regioisomérica de triazoles, la falta de regioselectividad no representa un problema importante para la mayoría de las aplicaciones actuales. Los requisitos más regioespecíficos y menos bioortogonales se satisfacen mejor mediante la cicloadición de Huisgen catalizada por cobre, especialmente dada la dificultad sintética (en comparación con la adición de un alquino terminal) de sintetizar un ciclooctino tensionado.

El OCT fue el primer ciclooctino desarrollado para la química click sin cobre. Si bien los alquinos lineales no reaccionan a temperaturas fisiológicas, el OCT reaccionó fácilmente con azidas en condiciones biológicas sin mostrar toxicidad. Sin embargo, era poco soluble en agua y su cinética apenas mejoró con respecto a la ligación de Staudinger. El ALO (octino sin arilo) se desarrolló para mejorar su solubilidad en agua, pero aún presentaba una cinética deficiente.

Los ciclooctinos monofluorados ( MOFO ) y difluorados ( DIFO ) se crearon para aumentar la velocidad mediante la adición de sustituyentes de flúor electroatractores en la posición propargílica . El flúor es un buen grupo electroatractor en términos de accesibilidad sintética e inercia biológica. En particular, no puede formar un aceptor de Michael electrófilo que pueda reaccionar secundariamente con nucleófilos biológicos. ^{[ 8 ]} El DIBO (dibenzociclooctino) se desarrolló como una fusión de dos anillos arílicos, lo que resultó en una tensión muy alta y una disminución en las energías de distorsión. Se propuso que la sustitución biarílica aumenta la tensión del anillo y proporciona conjugación con el alquino para mejorar la reactividad. Aunque los cálculos han predicho que la sustitución monoarílica proporcionaría un equilibrio óptimo entre el choque estérico (con la molécula de azida) y la tensión, ^{[ 20 ]} se ha demostrado que los productos monoarilados son inestables.

BARAC (biarilazaciclooctinona) se sintetizó con la adición de un enlace amida, lo que añade un centro tipo sp² para aumentar la velocidad de reacción por distorsión. La resonancia amida ^aporta tensión adicional sin generar insaturación adicional, lo que daría lugar a una molécula inestable. Además, la adición de un heteroátomo al anillo de ciclooctino mejora tanto la solubilidad como la farmacocinética de la molécula. BARAC presenta una velocidad (y sensibilidad) suficiente como para que no sea necesario eliminar el exceso de sonda mediante lavado para reducir el ruido de fondo. Esto lo hace extremadamente útil en situaciones donde el lavado es imposible, como en imágenes en tiempo real o imágenes de animales completos. Si bien BARAC es extremadamente útil, su baja estabilidad requiere que se almacene a 0  °C, protegido de la luz y el oxígeno. ^{[ 21 ]}

Se realizaron ajustes adicionales a BARAC para producir DIBAC/ADIBO, con el fin de aumentar la tensión del anillo distal y reducir el impedimento estérico alrededor del alquino, incrementando así la reactividad. El ceto-DIBO, en el que el grupo hidroxilo se ha convertido en una cetona, presenta una velocidad de reacción tres veces mayor debido a un cambio en la conformación del anillo. Los intentos de sintetizar un difluorobenzociclooctino ( DIFBO ) no tuvieron éxito debido a su inestabilidad.

Los problemas con DIFO en estudios in vivo con ratones ilustran la dificultad de producir reacciones bioortogonales. Aunque DIFO fue extremadamente reactivo en el marcaje de células, tuvo un desempeño deficiente en estudios con ratones debido a su unión con la albúmina sérica . La hidrofobicidad del ciclooctino promueve su secuestro por membranas y proteínas séricas, lo que reduce las concentraciones biodisponibles. En respuesta, se desarrolló DIMAC (dimetoxiazaciclooctino) para aumentar la solubilidad en agua, la polaridad y la farmacocinética, ^{[ 22 ]} aunque los esfuerzos en el marcaje bioortogonal de modelos de ratón aún están en desarrollo.

Los esfuerzos computacionales han sido fundamentales para explicar la termodinámica y la cinética de estas reacciones de cicloadición, lo que ha contribuido a la mejora continua de la reacción. Existen dos métodos para activar alquinos sin sacrificar la estabilidad: disminuir la energía del estado de transición o disminuir la estabilidad de los reactivos.

Disminución de la estabilidad del reactivo: Houk ^{[ 23 ]} ha propuesto que las diferencias en la energía (E _d ^‡ ) requerida para distorsionar la azida y el alquino en las geometrías del estado de transición controlan las alturas de barrera para la reacción. La energía de activación (E ^‡ ) es la suma de distorsiones desestabilizadoras e interacciones estabilizadoras (E _i ^‡ ). La distorsión más significativa está en el grupo funcional azida con una contribución menor de la distorsión del alquino. Sin embargo, es solo el ciclooctino que puede modificarse fácilmente para una mayor reactividad. Las barreras de reacción calculadas para la azida de fenilo y el acetileno (16,2 kcal/mol) frente al ciclooctino (8,0 kcal/mol) dan como resultado un aumento de velocidad predicho de 10 ⁶ . El ciclooctino requiere menos energía de distorsión (1,4 kcal/mol frente a 4,6 kcal/mol) lo que resulta en una energía de activación más baja a pesar de una energía de interacción más pequeña.

Disminución de la energía del estado de transición: Los grupos electroatractores como el flúor aumentan la velocidad al disminuir la energía LUMO y la brecha HOMO–LUMO . Esto conduce a una mayor transferencia de carga de la azida al ciclooctino fluorado en el estado de transición, aumentando la energía de interacción (valor negativo menor) y la energía de activación general. ^{[ 24 ]} La disminución del LUMO es el resultado de la hiperconjugación entre los orbitales donadores π del alquino y los aceptores σ* del CF. Estas interacciones proporcionan estabilización principalmente en el estado de transición como resultado de mayores capacidades donadoras/aceptoras de los enlaces a medida que se distorsionan. Los cálculos NBO han demostrado que la distorsión del estado de transición aumenta la energía de interacción en 2,8 kcal/mol.

La hiperconjugación entre los enlaces π fuera del plano es mayor debido a la mala alineación de los enlaces π en el plano. Sin embargo, la flexión del estado de transición permite que los enlaces π en el plano adopten una disposición más antiperiplanar que facilita la interacción. Se logra una estabilización adicional de la energía de interacción hiperconjugativa mediante un aumento en la población electrónica del σ* debido a la formación del enlace CN. La hiperconjugación negativa con los enlaces σ* CF potencia esta interacción estabilizadora. ^{[ 19 ]}

Aunque la regioselectividad no es un gran problema en las aplicaciones de imagen actuales de la química click sin cobre, sí es un problema que impide futuras aplicaciones en campos como el diseño de fármacos o los peptidomiméticos. ^{[ 25 ]}

Actualmente, la mayoría de los ciclooctinos reaccionan para formar mezclas regioisoméricas. [m] El análisis computacional ha encontrado que, si bien se calcula que la regioselectividad en fase gaseosa favorece la adición 1,5 sobre la adición 1,4 hasta en 2,9 kcal/mol en energía de activación, las correcciones de solvatación dan como resultado las mismas barreras de energía para ambos regioisómeros. Si bien el isómero 1,4 en la cicloadición de DIFO se ve desfavorecido por su mayor momento dipolar, la solvatación lo estabiliza más fuertemente que al isómero 1,5, erosionando la regioselectividad. ^{[ 24 ]}

Los ciclooctinos simétricos como el BCN (biciclo[6.1.0]nonino) forman un único regioisómero tras la cicloadición ^{[ 26 ]} y pueden servir para abordar este problema en el futuro.

La aplicación más extendida de la química click sin cobre se encuentra en la obtención de imágenes biológicas en células o animales vivos, utilizando una biomolécula marcada con azida y un ciclooctino que contiene un agente de imagen.

Las variantes fluorescentes ceto y oxima de DIBO se utilizan en reacciones de clic con interruptor de fluorescencia, en las que la fluorescencia del ciclooctino se extingue por el triazol que se forma en la reacción. ^{[ 27 ]} Por otro lado, se han desarrollado ciclooctinos conjugados con cumarina , como el coumBARAC, de modo que el alquino suprime la fluorescencia mientras que la formación de triazol aumenta el rendimiento cuántico de fluorescencia diez veces. ^{[ 28 ]}

Se ha investigado el control espacial y temporal del marcaje de sustratos mediante ciclooctinos fotoactivables. Esto permite el equilibrio del alquino antes de la reacción para reducir los artefactos resultantes de los gradientes de concentración. Los ciclooctinos enmascarados no reaccionan con azidas en la oscuridad, pero se convierten en alquinos reactivos al ser irradiados con luz. ^{[ 29 ]}

Se está explorando la química de clic sin cobre para su uso en la síntesis de agentes de imagen PET , los cuales deben elaborarse rápidamente con alta pureza y rendimiento para minimizar la degradación isotópica antes de su administración. Tanto las altas constantes de velocidad como la bioortogonalidad de SPAAC son adecuadas para la química PET. ^{[ 30 ]}

La química click sin cobre se ha adaptado para usar nitronas como el 1,3-dipolo en lugar de azidas y se ha utilizado en la modificación de péptidos. ^{[ 9 ]}

Esta cicloadición entre una nitrona y un ciclooctino forma isoxazolinas N-alquiladas. La velocidad de reacción aumenta con la presencia de agua y es extremadamente rápida, con constantes de velocidad de segundo orden que oscilan entre 12 y 32 ^M⁻¹  • s⁻¹ ^, dependiendo de la sustitución de la nitrona. Si bien la reacción es extremadamente rápida, presenta dificultades para incorporar la nitrona a biomoléculas mediante marcaje metabólico. El marcaje solo se ha logrado mediante modificación peptídica postraduccional.

Las cicloadiciones 1,3-dipolares se han desarrollado como una reacción bioortogonal utilizando un óxido de nitrilo como 1,3-dipolo y un norborneno como dipolarófilo. Su principal uso ha sido en el marcaje de ADN y ARN en sintetizadores de oligonucleótidos automatizados, ^{[ 31 ]} y en la reticulación de polímeros en presencia de células vivas. ^{[ 32 ]}

Los norbornenos se seleccionaron como dipolarófilos debido a su equilibrio entre reactividad inducida por tensión y estabilidad. Entre los inconvenientes de esta reacción se encuentran la reactividad cruzada del óxido de nitrilo, debida a su fuerte electrofilicidad, y la cinética lenta de la reacción.

La cicloadición de oxanorbornadieno es una cicloadición 1,3-dipolar seguida de una reacción retro- Diels-Alder para generar un conjugado unido a triazol con la eliminación de una molécula de furano . ^{[ 33 ]} Trabajos preliminares han establecido su utilidad en experimentos de marcaje de péptidos, y también se ha utilizado en la generación de compuestos de imagen SPECT . ^{[ 34 ]} Más recientemente, se describió el uso de un oxanorbornadieno en una reacción "iClick" a temperatura ambiente sin catalizador, en la que un aminoácido modelo se une a la porción metálica, en un enfoque novedoso para reacciones bioortogonales. ^{[ 35 ]}

La tensión del anillo y la deficiencia electrónica en el oxanorbornadieno aumentan la reactividad hacia la etapa limitante de la velocidad de cicloadición. La reacción de retro-Diels-Alder ocurre rápidamente después para formar el 1,2,3-triazol estable. Los problemas incluyen la baja tolerancia a los sustituyentes que pueden cambiar la electrónica del oxanorbornadieno y las bajas velocidades (constantes de velocidad de segundo orden del orden de 10⁻⁴ ⁾ .

La ligación de tetrazina es la reacción de un trans-cicloocteno y una s- tetrazina en una reacción de Diels-Alder de demanda inversa seguida de una reacción retro-Diels-Alder para eliminar el gas nitrógeno. ^{[ 36 ]} La reacción es extremadamente rápida con una constante de velocidad de segundo orden de 2000  M ⁻¹ –s ⁻¹ (en metanol/agua 9:1) lo que permite modificaciones de biomoléculas a concentraciones extremadamente bajas.

Según el trabajo computacional de Bach, la energía de tensión para los Z-ciclooctenos es de 7,0 kcal/mol en comparación con 12,4 kcal/mol para el ciclooctano debido a la pérdida de dos interacciones transanulares. El E-cicloocteno tiene un doble enlace altamente torsionado que resulta en una energía de tensión de 17,9 kcal/mol. ^{[ 37 ]} Por lo tanto, el trans-cicloocteno altamente tensionado se utiliza como dienófilo reactivo . El dieno es una 3,6-diaril-s-tetrazina que ha sido sustituida para resistir la reacción inmediata con agua. La reacción procede a través de una cicloadición inicial seguida de una reacción de Diels-Alder inversa para eliminar N₂ _y evitar la reversibilidad de la reacción. ^{[ 11 ]}

La reacción no solo tolera el agua, sino que se ha observado que su velocidad aumenta en medios acuosos. También se han realizado reacciones utilizando norbornenos como dienófilos, con velocidades de segundo orden del orden de 1 ^M⁻¹  • s⁻¹ ^en medios acuosos. Esta reacción se ha aplicado en el marcaje de células vivas ^{[ 38 ]} y en el acoplamiento de polímeros ^{[ 39 ] .}

Esta reacción de clic con isocianuro es una cicloadición [4+1] seguida de una eliminación retro-Diels-Alder de _N₂ . ^{[ 12 ]}

La reacción procede con una cicloadición [4+1] inicial seguida de una reversión para eliminar un sumidero termodinámico y evitar la reversibilidad. Este producto es estable si se utiliza una amina terciaria o un isocianopropanoato. Si se utiliza un isocianuro secundario o primario, el producto formará una imina que se hidroliza rápidamente.

El isocianuro es un indicador químico preferido debido a su pequeño tamaño, estabilidad, no toxicidad y ausencia en sistemas de mamíferos. Sin embargo, la reacción es lenta, con constantes de velocidad de segundo orden del orden de 10 ⁻²  M ⁻¹ •s ⁻¹ .

La química de fotoclic utiliza una cicloeliminación fotoinducida para liberar N₂ _. Esto genera un intermedio de imina 1,3-nitrilo de corta duración mediante la pérdida de nitrógeno gaseoso, que experimenta una cicloadición 1,3-dipolar con un alqueno para generar cicloaductos de pirazolina. ^{[ 12 ]}

La fotoinducción se produce con una breve exposición a la luz (la longitud de onda depende del tetrazol) para minimizar el fotodaño a las células. La reacción se ve potenciada en condiciones acuosas y genera un único regioisómero.

La imina de nitrilo transitoria es altamente reactiva para la cicloadición 1,3-dipolar debido a una estructura curvada que reduce la energía de distorsión. La sustitución con grupos dadores de electrones en los anillos fenilo aumenta la energía HOMO cuando se coloca en la imina de nitrilo 1,3 e incrementa la velocidad de reacción.

Las ventajas de este enfoque incluyen la capacidad de controlar la reacción espacial o temporalmente y la capacidad de incorporar tanto alquenos como tetrazoles en biomoléculas mediante métodos biológicos sencillos, como la codificación genética. ^{[ 40 ]} Además, el tetrazol puede diseñarse para ser fluorogénico con el fin de monitorizar el progreso de la reacción. ^{[ 41 ]}

La ligación de cuadriciclano utiliza un cuadriciclano altamente tensionado para experimentar una cicloadición [2+2+2] con sistemas π. ^{[ 13 ]}

El cuadriciclano es abiótico, no reacciona con biomoléculas (debido a su completa saturación), es relativamente pequeño y presenta una alta tensión (~80 kcal/mol). Sin embargo, es muy estable a temperatura ambiente y en condiciones acuosas a pH fisiológico. Reacciona selectivamente con sistemas π deficientes en electrones, pero no con alquenos, alquinos ni ciclooctinos simples.

Se seleccionó el bis(ditiobencil)níquel(II) como reactivo a partir de una serie de candidatos evaluados en función de su reactividad. Para evitar la reversión a norbornadieno inducida por la luz, se añade dietilditiocarbamato para quelar el níquel en el producto.

Estas reacciones se ven potenciadas por condiciones acuosas con una constante de velocidad de segundo orden de 0,25  M ⁻¹ •s ⁻¹ . Resulta de particular interés que se haya demostrado que es bioortogonal tanto a la formación de oximas como a la química click sin cobre.