Secuenciación CUT&Tag

La secuenciación CUT&Tag , también conocida como escisión bajo objetivos y tagmentación , es un método utilizado para analizar las interacciones de las proteínas con el ADN . La secuenciación CUT&Tag combina la escisión controlada dirigida por anticuerpos mediante una fusión de proteína A - Tn5 con la secuenciación masiva paralela de ADN para identificar los sitios de unión de las proteínas asociadas al ADN. Puede utilizarse para mapear con precisión los sitios de unión globales del ADN para cualquier proteína de interés. Actualmente, ChIP-Seq es la técnica más común utilizada para estudiar las relaciones proteína-ADN; sin embargo, presenta varias limitaciones prácticas y económicas que CUT&RUN y la secuenciación CUT&Tag no tienen. La secuenciación CUT&Tag supone una mejora con respecto a CUT&RUN, ya que no requiere la lisis celular ni el fraccionamiento de la cromatina. ^{[ 1 ]} CUT&RUN no es adecuado para plataformas de células individuales, por lo que CUT&Tag resulta ventajoso para estas. ^{[ 2 ]}

La secuenciación CUT&Tag se puede utilizar para examinar la regulación génica o para analizar la unión de factores de transcripción y otras proteínas asociadas a la cromatina. Las interacciones proteína-ADN regulan la expresión génica y son responsables de muchos procesos biológicos y estados patológicos. Esta información epigenética es complementaria al análisis de genotipo y expresión. CUT&Tag es una alternativa al estándar actual de ChIP-seq . ChIP-seq sufre limitaciones debido al paso de reticulación en los protocolos de ChIP-seq que puede promover el enmascaramiento de epítopos y generar sitios de unión falsos positivos. ^{[ 3 ] [ 4 ]} Además, ChIP-seq sufre de relaciones señal-ruido subóptimas y baja resolución. ^{[ 5 ]} La secuenciación CUT&RUN y CUT&Tag tienen la ventaja de ser técnicas más simples con menores costos debido a la alta relación señal-ruido, lo que requiere menor profundidad de secuenciación. ^{[ 6 ] [ 2 ]}

Mediante la unión de Tn5 conjugada con proteína A (pA) a una proteína de interés, se pueden aislar sitios específicos del ADN que interactúan directamente con proteínas como los factores de transcripción . La escisión mediada por Tn5 genera una biblioteca de sitios de ADN diana unidos a la proteína de interés in situ . La secuenciación de las bibliotecas de ADN preparadas y su comparación con bases de datos de secuencias del genoma completo permite a los investigadores analizar las interacciones entre las proteínas diana y el ADN, así como las diferencias en las modificaciones epigenéticas de la cromatina . Por lo tanto, el método CUT&Tag puede aplicarse a proteínas y modificaciones, incluyendo factores de transcripción , polimerasas , proteínas estructurales , modificaciones de proteínas y modificaciones del ADN.

La secuenciación CUT&RUN o CUT&Tag proporciona bajos niveles de señal de fondo gracias al perfilado in situ , que conserva confirmaciones 3D in vivo de las interacciones entre factores de transcripción y ADN, de modo que los anticuerpos acceden únicamente a las superficies expuestas. La sensibilidad de la secuenciación depende de la profundidad de la corrida de secuenciación (es decir, el número de etiquetas de secuencia mapeadas), el tamaño del genoma y la distribución del factor objetivo. La profundidad de secuenciación se correlaciona directamente con el coste y negativamente con el fondo. Por lo tanto, la secuenciación CUT&Tag de bajo fondo es intrínsecamente más rentable que la secuenciación ChIP de alto fondo.

La principal limitación de CUT&Tag es la probabilidad de sobredigestión del ADN debido a una sincronización inadecuada de la reacción Tn5 dependiente de magnesio. Una limitación similar existe para los protocolos ChIP-Seq contemporáneos, donde la fragmentación enzimática o por sonicación del ADN debe optimizarse. Al igual que con ChIP-Seq , se requiere un anticuerpo de buena calidad dirigido a la proteína de interés. Como con otras técnicas que utilizan Tn5, la preparación de la biblioteca tiene un fuerte sesgo de GC y una baja sensibilidad en regiones con bajo contenido de GC o genomas con alta varianza en el contenido de GC. ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]}

• Sono-Seq : Idéntico a ChIP-Seq pero sin el paso de inmunoprecipitación.
• HITS-CLIP : También llamado CLIP-Seq , se utiliza para detectar interacciones con ARN en lugar de ADN.
• PAR-CLIP : Un método para identificar los sitios de unión de las proteínas celulares de unión al ARN .
• RIP-Chip : Similar a ChIP-Seq, pero no emplea métodos de reticulación y utiliza análisis de microarrays en lugar de secuenciación.
• SELEX : Se emplea para determinar secuencias de unión consenso.
• Competition-ChIP : Mide la dinámica de reemplazo relativo en el ADN.
• ChiRP-Seq : Mide el ADN y las proteínas unidos al ARN.
• ChIP-exo : Emplea un tratamiento con exonucleasa para lograr una resolución de hasta un solo par de bases.
• ChIP-nexus : Posible mejora de ChIP-exo , capaz de alcanzar una resolución de hasta un solo par de bases.
• DRIP-seq : Emplea el anticuerpo S9.6 para precipitar híbridos de ARN:DND de tres hebras llamados bucles R.
• TCP-seq : Método fundamentalmente similar para medir la dinámica de la traducción del ARNm.
• DamID : Utiliza el enriquecimiento de secuencias de ADN metilado para detectar la interacción proteína-ADN sin necesidad de anticuerpos.
• CORTE Y EJECUCIÓN : Utiliza la proteína A-Mnasa.

• ChIP-on-chip
• ChIP-Seq
• CORTE Y FUGA
• ChIL-Seq
• ChIP-exo
• ATAC-seq