ChIP-on-chip

ChIP-on-chip (también conocido como ChIP-chip ) es una tecnología que combina la inmunoprecipitación de cromatina ('ChIP') con microarrays de ADN ( "chip" ). Al igual que el ChIP convencional , ChIP-on-chip se utiliza para investigar las interacciones entre proteínas y ADN in vivo . Específicamente, permite la identificación del cistroma , la suma de sitios de unión , para proteínas de unión al ADN a nivel genómico. ^{[ 1 ]} Se puede realizar un análisis del genoma completo para determinar las ubicaciones de los sitios de unión para casi cualquier proteína de interés. ^{[ 1 ]} Como sugiere el nombre de la técnica, dichas proteínas son generalmente aquellas que operan en el contexto de la cromatina . Los representantes más destacados de esta clase son los factores de transcripción , las proteínas relacionadas con la replicación , como la proteína del complejo de reconocimiento del origen (ORC), las histonas , sus variantes y las modificaciones de histonas.

El objetivo de ChIP-on-chip es localizar sitios de unión de proteínas que puedan ayudar a identificar elementos funcionales en el genoma . Por ejemplo, en el caso de un factor de transcripción como proteína de interés, se pueden determinar sus sitios de unión de factor de transcripción en todo el genoma. Otras proteínas permiten la identificación de regiones promotoras , potenciadores , represores y elementos de silenciamiento , aisladores , elementos de frontera y secuencias que controlan la replicación del ADN. ^{[ 2 ]} Si las histonas son objeto de interés, se cree que la distribución de modificaciones y sus localizaciones pueden ofrecer nuevas perspectivas sobre los mecanismos de regulación .

Uno de los objetivos a largo plazo para los que se diseñó ChIP-on-chip es establecer un catálogo de organismos (seleccionados) que registre todas las interacciones proteína-ADN en diversas condiciones fisiológicas. Este conocimiento contribuiría a comprender los mecanismos de regulación génica, proliferación celular y progresión de enfermedades. Por lo tanto, ChIP-on-chip ofrece el potencial de complementar nuestro conocimiento sobre la organización del genoma a nivel de nucleótidos e información sobre niveles superiores de información y regulación, gracias a la investigación en epigenética .

Las plataformas técnicas para realizar experimentos ChIP-on-chip son los microarrays de ADN , o "chips" . Se pueden clasificar y distinguir según diversas características:

Tipo de sonda : Los microarrays de ADN pueden estar compuestos por ADNc o productos de PCR depositados mecánicamente , oligonucleótidos depositados mecánicamente u oligonucleótidos sintetizados in situ . Las primeras versiones de microarrays se diseñaron para detectar ARN de regiones genómicas expresadas ( marcos de lectura abiertos , también conocidos como ORF). Si bien estos microarrays son ideales para estudiar perfiles de expresión génica , su utilidad en experimentos de ChIP es limitada, ya que la mayoría de las proteínas de interés para esta técnica se unen a regiones intergénicas . Actualmente, incluso se pueden diseñar y ajustar microarrays personalizados para que se adapten a los requisitos de cada experimento. Además, se puede sintetizar cualquier secuencia de nucleótidos para cubrir tanto regiones génicas como intergénicas.

Tamaño de la sonda : Las primeras versiones de los microarrays de ADNc tenían una longitud de sonda de aproximadamente 200 pb. Las versiones más recientes utilizan oligonucleótidos de tan solo 70 nucleótidos (Microarrays, Inc.) a 25 nucleótidos ( Affymetrix ). (Febrero de 2007)

Composición de las sondas : Existen matrices de ADN en mosaico y no en mosaico. Las matrices no en mosaico utilizan sondas seleccionadas según criterios no espaciales; es decir, las secuencias de ADN utilizadas como sondas no tienen distancias fijas en el genoma. Las matrices en mosaico, en cambio, seleccionan una región genómica (o incluso un genoma completo) y la dividen en fragmentos iguales. Dicha región se denomina ruta en mosaico. La distancia promedio entre cada par de fragmentos vecinos (medida desde el centro de cada fragmento) proporciona la resolución de la ruta en mosaico. Una ruta puede superponerse, ser continua o estar espaciada. ^{[ 3 ]}

Tamaño del array : Los primeros microarrays utilizados para ChIP-on-Chip contenían aproximadamente 13.000 segmentos de ADN marcados que representaban todos los ORF y regiones intergénicas del genoma de la levadura. ^{[ 2 ]} Actualmente, Affymetrix ofrece arrays de levadura con cobertura de todo el genoma con una resolución de 5 pb (un total de 3,2 millones de sondas). Los arrays con cobertura del genoma humano también son cada vez más potentes. Por ejemplo, Affymetrix ofrece un conjunto de siete arrays con aproximadamente 90 millones de sondas, que abarcan la parte no repetitiva completa del genoma humano con un espaciado de aproximadamente 35 pb. (Febrero de 2007) Además del propio microarray, se necesita otro equipo de hardware y software para realizar experimentos de ChIP-on-Chip. Generalmente, los microarrays de una empresa no pueden ser analizados por el hardware de procesamiento de otra empresa. Por lo tanto, comprar un array requiere también comprar el equipo de flujo de trabajo asociado. Entre los elementos más importantes se encuentran los hornos de hibridación, los escáneres de chips y los paquetes de software para el posterior análisis numérico de los datos brutos.

Partiendo de una pregunta biológica, un experimento ChIP-on-chip se divide en tres pasos principales: El primero consiste en configurar y diseñar el experimento seleccionando el tipo de matriz y sonda adecuados. El segundo, se lleva a cabo el experimento en el laboratorio húmedo. Por último, durante la fase de laboratorio seco, se analizan los datos recopilados para responder a la pregunta inicial o plantear nuevas preguntas, de modo que el ciclo pueda reiniciarse.

Parte del flujo de trabajo que se realiza en el laboratorio húmedo.

En la primera etapa, la proteína de interés (POI) se une al sitio de ADN al que se enlaza en un entorno in vitro . Generalmente, esto se realiza mediante una fijación suave con formaldehído que es reversible con calor.

A continuación, las células se lisan y el ADN se fragmenta mediante sonicación o con nucleasa microcócica . Esto da como resultado fragmentos de ADN de doble cadena, normalmente de 1 kb o menos de longitud. Aquellos que se unieron covalentemente a la proteína de interés forman un complejo proteína de interés-ADN.

En el siguiente paso, solo estos complejos se filtran del conjunto de fragmentos de ADN mediante un anticuerpo específico para la proteína de interés (POI). Los anticuerpos pueden estar unidos a una superficie sólida, tener una microesfera magnética o alguna otra propiedad física que permita la separación de los complejos entrecruzados y los fragmentos no unidos. Este procedimiento es esencialmente una inmunoprecipitación (IP) de la proteína. Esto se puede realizar utilizando una proteína marcada con un anticuerpo contra la etiqueta (por ejemplo, FLAG , HA , c-myc) o con un anticuerpo contra la proteína nativa.

La reticulación de los complejos POI-ADN se revierte (generalmente mediante calentamiento) y las hebras de ADN se purifican. Para el resto del proceso, el POI ya no es necesario.

Tras un paso de amplificación y desnaturalización , los fragmentos de ADN monocatenario se marcan con una etiqueta fluorescente como Cy5 o Alexa 647.

Finalmente, los fragmentos se vierten sobre la superficie del microchip de ADN, que está marcado con secuencias cortas de cadena sencilla que cubren la porción genómica de interés. Cuando un fragmento marcado encuentra un fragmento complementario en el microchip, se hibridan y forman nuevamente un fragmento de ADN de doble cadena.

Parte del flujo de trabajo correspondiente al laboratorio en seco.

Tras un intervalo de tiempo suficientemente largo para permitir la hibridación, la matriz se ilumina con luz fluorescente. Las sondas de la matriz que se hibridan con uno de los fragmentos marcados emiten una señal luminosa que es captada por una cámara. Esta imagen contiene todos los datos brutos del resto del proceso.

Estos datos brutos, codificados como imágenes de falso color , deben convertirse a valores numéricos antes de poder realizar el análisis propiamente dicho. El análisis y la extracción de información de los datos brutos suelen ser la parte más compleja de los experimentos ChIP-on-chip. Surgen problemas a lo largo de esta parte del flujo de trabajo, desde la lectura inicial del chip hasta los métodos adecuados para sustraer el ruido de fondo y, finalmente, los algoritmos apropiados que normalizan los datos y los ponen a disposición para el análisis estadístico posterior , lo que, con suerte, conducirá a una mejor comprensión de la cuestión biológica que el experimento pretende abordar. Además, debido a las diferentes plataformas de matrices y la falta de estandarización entre ellas, el almacenamiento e intercambio de datos es un problema enorme. En términos generales, el análisis de datos se puede dividir en tres pasos principales:

En la primera etapa, las señales de fluorescencia capturadas por la matriz se normalizan utilizando señales de control obtenidas del mismo chip o de un segundo chip. Estas señales de control indican qué sondas de la matriz se hibridaron correctamente y cuáles se unieron de forma inespecífica.

En la segunda etapa, se aplican pruebas numéricas y estadísticas a los datos de control y a los datos de fracción IP para identificar regiones enriquecidas con POI a lo largo del genoma. Se utilizan ampliamente los siguientes tres métodos: percentil mediano , error de matriz única y ventana deslizante . Estos métodos generalmente difieren en cómo se manejan las señales de baja intensidad, cuánto ruido de fondo se acepta y qué característica de los datos se enfatiza durante el cálculo. En el pasado reciente, el enfoque de ventana deslizante parece ser el preferido y a menudo se describe como el más potente.

En el tercer paso, estas regiones se analizan con mayor detalle. Si, por ejemplo, la proteína de interés fuera un factor de transcripción, dichas regiones representarían sus sitios de unión. El análisis posterior podría entonces buscar inferir motivos de nucleótidos y otros patrones para permitir la anotación funcional del genoma. ^{[ 4 ]}

Mediante el uso de matrices en mosaico , la técnica ChIP -on-chip permite obtener mapas genómicos de alta resolución. Estos mapas pueden determinar los sitios de unión de numerosas proteínas que se unen al ADN, como los factores de transcripción, así como las modificaciones de la cromatina.

Aunque la técnica ChIP-on-chip puede ser muy potente en el campo de la genómica, es muy costosa. La mayoría de los estudios publicados que utilizan ChIP-on-chip repiten sus experimentos al menos tres veces para garantizar mapas biológicamente significativos. El coste de los microarrays de ADN suele ser un factor limitante para que un laboratorio decida si realizar un experimento de ChIP-on-chip. Otra limitación es el tamaño de los fragmentos de ADN que se pueden obtener. La mayoría de los protocolos de ChIP-on-chip utilizan la sonicación como método para fragmentar el ADN en trozos pequeños. Sin embargo, la sonicación está limitada a un tamaño mínimo de fragmento de 200 pb. Para obtener mapas de mayor resolución, esta limitación debe superarse para conseguir fragmentos más pequeños, preferiblemente con resolución de un solo nucleosoma . Como se mencionó anteriormente, el análisis estadístico de la enorme cantidad de datos generados por los microarrays es un reto, y los procedimientos de normalización deben tener como objetivo minimizar los artefactos y determinar qué es realmente significativo desde el punto de vista biológico. Hasta ahora, la aplicación a genomas de mamíferos ha sido una limitación importante, por ejemplo, debido al elevado porcentaje del genoma que está ocupado por repeticiones. Sin embargo, a medida que avanza la tecnología ChIP-on-chip, debería ser posible obtener mapas del genoma completo de mamíferos con alta resolución.

Los anticuerpos utilizados para ChIP -on-chip pueden ser un factor limitante importante. ChIP -on-chip requiere anticuerpos altamente específicos que deben reconocer su epítopo tanto en solución libre como en condiciones fijas. Si se demuestra que un anticuerpo inmunoprecipita con éxito la cromatina reticulada , se denomina " de grado ChIP ". Entre las empresas que proporcionan anticuerpos de grado ChIP se encuentran Abcam , Cell Signaling Technology , Santa Cruz y Upstate. Para superar el problema de la especificidad, la proteína de interés puede fusionarse a una etiqueta como FLAG o HA , que son reconocidas por los anticuerpos. Una alternativa a ChIP-on-chip que no requiere anticuerpos es DamID .

También se encuentran disponibles anticuerpos contra una modificación específica de histonas, como la H3 trimetil K4. Como se mencionó anteriormente, la combinación de estos anticuerpos y la técnica ChIP-on-chip se ha vuelto extremadamente eficaz para determinar los patrones de modificación de histonas en el análisis del genoma completo y contribuirá enormemente a nuestra comprensión del código de histonas y la epigenética.

Un estudio que demuestra la naturaleza no específica de las proteínas de unión al ADN se ha publicado en PLoS Biology. Esto indica que la confirmación alternativa de la relevancia funcional es un paso necesario en cualquier experimento de ChIP-chip. ^{[ 5 ]}

Un primer experimento de ChIP-on-chip se realizó en 1999 para analizar la distribución de la cohesina a lo largo del cromosoma III de la levadura en gemación . ^{[ 6 ]} Aunque el genoma no estaba completamente representado, el protocolo en este estudio sigue siendo equivalente a los utilizados en estudios posteriores. La técnica de ChIP-on-chip utilizando todos los ORF del genoma (que, sin embargo, sigue estando incompleto, faltando regiones intergénicas) se aplicó luego con éxito en tres artículos publicados en 2000 y 2001. ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ]} Los autores identificaron sitios de unión para factores de transcripción individuales en la levadura en gemación Saccharomyces cerevisiae . En 2002, el grupo de Richard Young ^{[ 10 ]} determinó las posiciones en todo el genoma de 106 factores de transcripción utilizando un sistema de etiquetado c-Myc en levadura. La primera demostración de la técnica ChIP-on-chip en mamíferos, que reportó el aislamiento de nueve fragmentos de cromatina que contenían sitios de unión E2F débiles y fuertes, fue realizada por el laboratorio de Peggy Farnham en colaboración con el laboratorio de Michael Zhang y publicada en 2001. ^{[ 11 ]} Este estudio fue seguido varios meses después en una colaboración entre el laboratorio de Young con el laboratorio de Brian Dynlacht, que utilizó la técnica ChIP-on-chip para mostrar por primera vez que los objetivos de E2F codifican componentes del punto de control del daño del ADN y las vías de reparación, así como factores involucrados en el ensamblaje/condensación de la cromatina, la segregación cromosómica y el punto de control del huso mitótico ^{[ 12 ]} Otras aplicaciones para ChIP-on-chip incluyen la replicación del ADN , la recombinación y la estructura de la cromatina. Desde entonces, ChIP-on-chip se ha convertido en una herramienta poderosa para determinar mapas de todo el genoma de modificaciones de histonas y muchos más factores de transcripción. ChIP-on-chip en sistemas de mamíferos ha sido difícil debido a los genomas grandes y repetitivos. Por lo tanto, muchos estudios en células de mamíferos se han centrado en regiones promotoras específicas que se predice que se unen a factores de transcripción, sin analizar el genoma completo. Sin embargo, recientemente se han comercializado microarrays del genoma completo de mamíferos a través de empresas como Nimblegen. En el futuro, a medida que los microarrays ChIP-on-chip se perfeccionen, se analizarán con mayor detalle mapas del genoma completo de alta resolución de proteínas de unión al ADN y componentes de la cromatina en mamíferos.

Introducida en 2007, la secuenciación ChIP (ChIP-seq) es una tecnología que utiliza la inmunoprecipitación de cromatina para unir las proteínas de interés al ADN, pero en lugar de utilizar un microarreglo, utiliza el método de secuenciación, más preciso y de mayor rendimiento, para localizar los puntos de interacción. ^{[ 13 ]}

DamID es un método alternativo que no requiere anticuerpos.

La técnica ChIP-exo utiliza un tratamiento con exonucleasa para lograr una resolución de hasta un solo par de bases.

La secuenciación CUT&RUN utiliza el reconocimiento de anticuerpos con una escisión enzimática dirigida para solucionar algunas limitaciones técnicas de ChIP.

• Johnson, WE; Li, W.; Meyer, CA; Gottardo, R.; Carroll, JS; Brown, M.; Liu, XS (2006). "Análisis basado en modelos de matrices de mosaico para ChIP-chip" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 103 (33 ) : 12457– 12462. Bibcode : 2006PNAS..10312457J . doi : 10.1073/pnas.0601180103 . ISSN 0027-8424 . PMC 1567901. PMID 16895995 .   
• Benoukraf, Touati ; Cauchy, Pedro; Fenouil, Romain; Jeanniard, Adrián; Koch, Federico; Jaeger, Sébastien; Ladrón, Denis; Imbert, Jean; Andrau, Jean-Christophe; Spicuglia, Salvatore; Ferrier, Pierre (2009). "CoCAS: un conjunto de análisis de chip en chip" . Bioinformática . 25 (7): 954– 955. doi : 10.1093/bioinformatics/btp075 . ISSN 1460-2059 . PMC 2660873 . PMID 19193731 .   

• http://www.genome.gov/10005107 Proyecto ENCODE
• Información sobre el encapsulado Chip-on-Chip (CoC) de Amkor Technology