ClickSeq

ClickSeq es un método basado en química de clic para generar bibliotecas de secuenciación de próxima generación para plataformas de secuenciación profunda, incluidas Illumina , HiSeq, MiSeq y NextSeq. ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]} Su función es similar a la de la mayoría de las otras técnicas para generar bibliotecas de RNAseq o DNAseq , ya que tiene como objetivo generar fragmentos aleatorios de muestras biológicas de ARN o ADN y agregar adaptadores de secuenciación específicos a cualquiera de los extremos de cada fragmento, según los requisitos de la plataforma de secuenciación particular que se vaya a utilizar (por ejemplo, HiSeq).

En ClickSeq, las reacciones de transcripción inversa (RT) se complementan con pequeñas cantidades de nucleótidos 3'- azido (AzNTP) en proporciones definidas con respecto a los desoxirribonucleótidos (dNTP). Los AzNTP son terminadores de cadena y, por lo tanto, inducen la terminación estocástica de la síntesis de ADNc a una longitud promedio determinada por la proporción de AzNTP a dNTP. Esto da como resultado la producción de fragmentos de ADNc monocatenarios que contienen un grupo azido en sus extremos 3'. Estas moléculas de ADNc bloqueadas con 3'-azido se purifican separándolas de los componentes de la reacción de RT y, posteriormente, se "ligan mediante clic" ^{[ 4 ] [ 5 ]} a adaptadores de ADN modificados con alquino en 5' mediante cicloadición azida-alquino catalizada por cobre (CuAAC). ^{[ 6 ]} Esto genera moléculas de ADN monocatenario con esqueletos de ADN unidos por triazol no naturales . No obstante, estas plantillas se utilizan en reacciones de PCR y se amplifican para generar una biblioteca de secuenciación de ADNc con los adaptadores de secuenciación 5' y 3' apropiados e índices necesarios para la secuenciación de próxima generación. ClickSeq se ha utilizado predominantemente para secuenciar genomas de ARN virales como el virus Flock House , ^{[ 7 ] [ 8 ]} el virus de la parálisis del grillo , ^{[ 9 ]} y el virus Zika , ^{[ 10 ]} debido a su resistencia a la formación de quimeras artificiales.

Poly(A)-ClickSeq es una variante de ClickSeq diseñada para dirigirse a la unión de la región 3' no traducida (UTR) y las colas de poli(A) de los ARN mensajeros (ARNm) de organismos superiores y de virus de ARN que infectan estos tipos de células. ^{[ 11 ]} El principio básico es similar al de ClickSeq; sin embargo, el paso de retrotranscripción utiliza un cebador oligo-dT (sin anclaje) para iniciar la síntesis de ADNc desde dentro de la cola de poli(A) y solo se complementan tres nucleótidos azido 3' (AzATP, AzGTP y AzCTP, denominados colectivamente AzVTP). Debido a la omisión de AzTTP, no puede ocurrir una terminación estocástica de la síntesis de ADNc durante la retrotranscripción de la cola de poli(A). En cambio, la terminación solo puede ocurrir en la UTR 3' a una distancia corriente arriba de la cola de poli(A) definida por la proporción de AzVTP a dNTP.

ClickSeq y Poly(A)-ClickSeq ofrecen aplicaciones específicas que las diferencian de otras técnicas comunes de secuenciación de ARN. Estas incluyen:

• Eliminación de los pasos de fragmentación del ARN: Cuando el paso de retrotranscripción se inicia con cebadores aleatorios y la síntesis de ADNc se termina con los nucleótidos 3'-azido, se pueden generar fragmentos de ADNc sin fragmentación química, mecánica o enzimática del ARN de la muestra.
• Eliminación de enzimas ligasas de ARN/ADN: En ClickSeq, no hay pasos de ligación de ARN o ADN , como se requiere comúnmente en la mayoría de las estrategias de síntesis de bibliotecas de secuenciación de próxima generación ^{[ 12 ].}
• Reducción de la recombinación artificial: En la publicación original de ClickSeq, ^{[ 13 ]} Routh et al. demostraron que la generación artificial de quimeras de ADNc se redujo sustancialmente al usar ClickSeq. Esto permitió a los autores detectar eventos raros de recombinación de ARN que surgen durante la replicación del virus Flock House .
• La técnica Poly(A)-ClickSeq no requiere el enriquecimiento ni la purificación de ARNm o ARN virales a partir de muestras biológicas. De hecho, puede realizarse de forma sencilla directamente a partir de ARN crudo o ARN celular total extraído de muestras biológicas.
• El catalizador de cobre necesario para la CuAAC puede inducir daño oxidativo del ADN molde ^{[ 14 ].}