Análisis combinado de restricción con bisulfito

El análisis combinado de restricción con bisulfito (o COBRA ) es una técnica de biología molecular que permite la cuantificación sensible de los niveles de metilación del ADN en un locus genómico específico de una secuencia de ADN en una pequeña muestra de ADN genómico. ^{[ 1 ]} La técnica es una variación de la secuenciación con bisulfito y combina la reacción en cadena de la polimerasa basada en la conversión con bisulfito con la digestión con enzimas de restricción . Desarrollada originalmente para manejar de forma fiable cantidades minúsculas de ADN genómico de muestras de tejido microdiseccionado e incluido en parafina , la técnica se ha utilizado ampliamente en la investigación del cáncer y en estudios epigenéticos . ^{[ 2 ]}

COBRA se ha utilizado ampliamente en numerosas aplicaciones de investigación, como la detección de cambios en la metilación del ADN en promotores genéticos en estudios de cáncer, ^{[ 3 ] [ 4 ]} la detección de patrones de metilación alterados en genes improntados , ^{[ 5 ]} y la caracterización de patrones de metilación en el genoma durante el desarrollo en mamíferos. ^{[ 6 ] [ 7 ]}

En medicina, COBRA se ha utilizado como herramienta para ayudar a diagnosticar enfermedades humanas que implican metilación aberrante del ADN. Los investigadores utilizaron COBRA junto con cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante en el diagnóstico del síndrome de Russell-Silver, un trastorno de impronta genética en el que la hipometilación del gen H19, sujeto a impronta , es responsable del trastorno en hasta el 50 % de los pacientes. ^{[ 8 ]}

• Sencillo, rápido y económico : En COBRA, los niveles de metilación del ADN se miden de forma fácil y rápida sin necesidad de subclonación ni secuenciación laboriosas , como ocurre con la secuenciación con bisulfito. El ensayo es sencillo y se puede realizar con reactivos de biología molecular estándar y económicos.
• Alta compatibilidad : Gracias a los pasos de PCR y purificación, el método no solo funciona con cantidades muy pequeñas de ADN genómico, sino también con muestras que han sido tratadas con parafina, dos aspectos que pueden resultar problemáticos en otros protocolos de cuantificación de la metilación del ADN, como la transferencia Southern y la digestión con enzimas de restricción sensibles a la metilación seguida de PCR.
• Cuantitativo : Esto contrasta con la PCR específica de metilación , que es cualitativa. Con COBRA, los niveles de metilación del ADN se pueden cuantificar directamente en un locus determinado, lo que proporciona más información por ensayo.
• Escalabilidad para el procesamiento de muestras de alto rendimiento : Con COBRA, se pueden procesar en paralelo numerosas regiones de interés en muestras separadas digeridas con la misma enzima de restricción. Esto contrasta con el análisis de secuenciación con bisulfito, donde cada región debe examinarse minuciosamente mediante la secuenciación de muchos clones por locus, lo que requiere más tiempo.
• Múltiples consultas por ensayo : El estado de metilación se puede analizar en múltiples sitios de restricción que contienen CpG en un solo ensayo de digestión.

• El ensayo se limita al uso de sitios de restricción existentes en la región de interés, y la metilación que no se produzca en el contexto de un sitio de restricción específico no se analizará.
• La digestión incompleta por enzimas de restricción después de la PCR puede confundir el análisis: una digestión incompleta sugeriría falta de metilación del ADN (si se corta con una enzima sensible a la metilación como HpaII). También se sabe que BstUI puede cortar en sitios no convertidos, lo que lleva a una sobreestimación de los niveles de metilación y, por lo tanto, a menudo es necesario el uso de HpaII. ^{[ 9 ]}
• En muestras complejas, la heterogeneidad celular puede dificultar el análisis, ya que el ADN no se secuencia. La heterogeneidad en las secuencias de diferentes células de la muestra ( es decir, distintas poblaciones celulares dentro de un tumor) que han adquirido mutaciones en la región analizada, como el cambio del dinucleótido CG a CA o CT, provocaría la pérdida del sitio de restricción, dando lugar a una región aparentemente metilada debido a la falta de digestión. Esto distorsionaría la cuantificación de los niveles de metilación del ADN en una muestra determinada.

En general, COBRA se suele combinar con otros análisis de metilación del ADN y se utiliza con frecuencia en la evaluación inicial de un locus de interés. Si COBRA sugiere patrones de metilación alterados, se pueden aplicar técnicas más rigurosas y laboriosas, como la secuenciación con bisulfito o MeDIP . La secuenciación PacBio también puede utilizarse para detectar la metilación del ADN.