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Secuenciación con bisulfito

Figura 1: Esquema de la conversión con bisulfito de una secuencia de ADN genómico de muestra. Los nucleótidos en azul son citosinas no metiladas convertidas en uracilos por acci...

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Figura 1: Esquema de la conversión con bisulfito de una secuencia de ADN genómico de muestra. Los nucleótidos en azul son citosinas no metiladas convertidas en uracilos por acción del bisulfito, mientras que los nucleótidos en rojo son 5-metilcitosinas resistentes a la conversión.
Figura 2: Esquema de la reacción química que subyace a la conversión de citosina a uracilo catalizada por bisulfito.

La secuenciación con bisulfito [ 1 ] (también conocida como secuenciación con bisulfito ) es el uso del tratamiento con bisulfito del ADN antes de la secuenciación de rutina para determinar el patrón de metilación . La metilación del ADN fue la primera marca epigenética descubierta y sigue siendo la más estudiada. En animales, implica predominantemente la adición de un grupo metilo a la posición del carbono 5 de los residuos de citosina del dinucleótido CpG , y está implicada en la represión de la actividad transcripcional .

El tratamiento del ADN con bisulfito convierte los residuos de citosina en uracilo , pero deja intactos los residuos de 5-metilcitosina . Por lo tanto, el ADN tratado con bisulfito conserva únicamente las citosinas metiladas. Así, el tratamiento con bisulfito introduce cambios específicos en la secuencia de ADN que dependen del estado de metilación de cada residuo de citosina, lo que proporciona información con resolución de un solo nucleótido sobre el estado de metilación de un segmento de ADN. Se pueden realizar diversos análisis sobre la secuencia alterada para recuperar esta información. El objetivo de este análisis se reduce, por lo tanto, a diferenciar entre los polimorfismos de un solo nucleótido (citosinas y timidina ) resultantes de la conversión con bisulfito (Figura 1).

Métodos

La secuenciación con bisulfito aplica métodos de secuenciación convencionales al ADN genómico tratado con bisulfito para determinar el estado de metilación en los dinucleótidos CpG. También se emplean otras estrategias no basadas en la secuenciación para analizar la metilación en loci específicos o a nivel genómico . Todas las estrategias parten de la base de que la conversión de citosinas no metiladas a uracilo inducida por bisulfito es completa, lo que constituye la base de todas las técnicas posteriores. Idealmente, el método utilizado determinaría el estado de metilación de cada alelo por separado . Entre los métodos alternativos a la secuenciación con bisulfito se incluyen el análisis combinado de restricción con bisulfito y la inmunoprecipitación de ADN metilado (MeDIP).

Se están desarrollando continuamente metodologías para analizar ADN tratado con bisulfito. Para resumir estas metodologías en rápida evolución, se han escrito numerosos artículos de revisión. [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]

Las metodologías se pueden dividir generalmente en estrategias basadas en PCR específica de metilación (MSP) (Figura 4) y estrategias que emplean la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) realizada en condiciones no específicas de metilación (Figura 3). Los métodos basados ​​en microarrays también utilizan PCR en condiciones no específicas de metilación.

Métodos basados ​​en PCR no específicos para la metilación

Figura 3: Métodos de análisis de metilación del ADN no basados ​​en PCR específica para metilación. Tras la conversión con bisulfito, el ADN genómico se amplifica mediante PCR, que no distingue entre secuencias metiladas y no metiladas. Posteriormente, se utilizan los numerosos métodos disponibles para realizar la discriminación en función de los cambios dentro del amplicón como resultado de la conversión con bisulfito.

Secuenciación directa

El primer método de análisis de metilación reportado utilizando ADN tratado con bisulfito empleó PCR y secuenciación de ADN con dideoxinucleótidos estándar para determinar directamente los nucleótidos resistentes a la conversión con bisulfito. [ 6 ] Los cebadores están diseñados para ser específicos de la cadena, así como específicos del bisulfito (es decir, cebadores que contienen citosinas no CpG, de modo que no son complementarios al ADN no tratado con bisulfito), flanqueando (pero sin involucrar) el sitio de metilación de interés. Por lo tanto, amplificará tanto secuencias metiladas como no metiladas, a diferencia de la PCR específica de metilación. Todos los sitios de citosinas no metiladas se muestran como timinas en la secuencia amplificada resultante de la cadena sentido, y como adeninas en la cadena antisentido amplificada . Al incorporar adaptadores de secuenciación de alto rendimiento en los cebadores de PCR, los productos de PCR pueden secuenciarse con secuenciación masiva en paralelo. Alternativamente, y de manera laboriosa, el producto de PCR puede clonarse y secuenciarse. Se pueden utilizar métodos de PCR anidada para mejorar el producto para la secuenciación .

Todas las técnicas posteriores de análisis de metilación del ADN que utilizan ADN tratado con bisulfito se basan en este informe de Frommer et al. (Figura 2). [ 6 ] Aunque la mayoría de las demás modalidades no son técnicas de secuenciación propiamente dichas, el término "secuenciación con bisulfito" se utiliza a menudo para describir las técnicas de análisis de metilación del ADN con conversión de bisulfito en general.

pirosecuenciación

La pirosecuenciación también se ha utilizado para analizar ADN tratado con bisulfito sin emplear PCR específica de metilación. [ 7 ] [ 8 ] Tras la amplificación por PCR de la región de interés, la pirosecuenciación se utiliza para determinar la secuencia convertida por bisulfito de sitios CpG específicos en la región. La proporción de C a T en sitios individuales se puede determinar cuantitativamente en función de la cantidad de C y T incorporadas durante la extensión de la secuencia. La principal limitación de este método es el coste de la tecnología. Sin embargo, la pirosecuenciación permite su extensión a métodos de cribado de alto rendimiento .

Una variante de esta técnica, descrita por Wong et al. , utiliza cebadores específicos de alelo que incorporan polimorfismos de un solo nucleótido en la secuencia del cebador de secuenciación, lo que permite el análisis separado de los alelos maternos y paternos . [ 9 ] Esta técnica es de particular utilidad para el análisis de impronta genómica .

Análisis de conformación de cadena simple sensible a la metilación (MS-SSCA)

Este método se basa en el análisis de polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCA), desarrollado para el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). [ 10 ] El SSCA diferencia entre fragmentos de ADN de cadena simple de tamaño idéntico pero secuencia distinta, basándose en la migración diferencial en electroforesis no desnaturalizante . En MS-SSCA, esto se utiliza para distinguir entre regiones amplificadas por PCR y tratadas con bisulfito que contienen los sitios CpG de interés. Aunque el SSCA carece de sensibilidad cuando solo hay una diferencia de un nucleótido , el tratamiento con bisulfito frecuentemente produce varias conversiones de C a T en la mayoría de las regiones de interés, y la sensibilidad resultante se acerca al 100%. El MS-SSCA también proporciona un análisis semicuantitativo del grado de metilación del ADN basado en la relación de intensidades de banda. Sin embargo, este método está diseñado para evaluar todos los sitios CpG en su conjunto en la región de interés, en lugar de sitios de metilación individuales.

Análisis de fusión de alta resolución (HRM)

Otro método para diferenciar el ADN tratado con bisulfito convertido del no convertido es el análisis de fusión de alta resolución (HRM), una técnica cuantitativa basada en PCR diseñada inicialmente para distinguir SNP. [ 11 ] Los amplicones de PCR se analizan directamente mediante rampa de temperatura y la consiguiente liberación de un colorante fluorescente intercalante durante la fusión. El grado de metilación, representado por el contenido de C a T en el amplicón , determina la rapidez de la fusión y la consiguiente liberación del colorante. Este método permite la cuantificación directa en un ensayo de un solo tubo, pero evalúa la metilación en la región amplificada en su conjunto en lugar de en sitios CpG específicos .

Extensión de cebadores de un solo nucleótido sensibles a la metilación (MS-SnuPE)

MS-SnuPE emplea el método de extensión de cebadores diseñado inicialmente para analizar polimorfismos de un solo nucleótido . [ 12 ] El ADN se convierte con bisulfito y los cebadores específicos para bisulfito se hibridan a la secuencia hasta el par de bases inmediatamente anterior al CpG de interés. Se permite que el cebador se extienda un par de bases hacia la C (o T) utilizando dideoxinucleótidos terminadores de ADN polimerasa , y se determina cuantitativamente la proporción de C a T.

Se pueden utilizar varios métodos para determinar esta relación C:T. Inicialmente, MS-SnuPE se basaba en ddNTPs radiactivos como reporteros de la extensión del cebador. También se pueden utilizar métodos basados ​​en fluorescencia o pirosecuenciación . [ 13 ] Sin embargo, el análisis de espectrometría de masas de tiempo de vuelo/desorción láser asistida por matriz ( MALDI-TOF ) para diferenciar entre los dos productos polimórficos de extensión del cebador se puede utilizar, esencialmente, basándose en el ensayo GOOD diseñado para la genotipificación de SNP . La cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa de pares iónicos (IP-RP- HPLC ) también se ha utilizado para distinguir los productos de extensión del cebador. [ 14 ]

Escisión específica de bases/MALDI-TOF

Un método descrito recientemente por Ehrich et al. aprovecha aún más las conversiones de bisulfito al agregar un paso de escisión específica de base para mejorar la información obtenida de los cambios de nucleótidos. [ 15 ] Al usar primero la transcripción in vitro de la región de interés en ARN (al agregar un sitio promotor de ARN polimerasa al cebador de PCR en la amplificación inicial), la RNasa A puede usarse para escindir el transcrito de ARN en sitios específicos de base. Como la RNasa A escinde el ARN específicamente en ribonucleótidos de citosina y uracilo , la especificidad de base se logra agregando incorporando dTTP resistente a la escisión cuando se desea la escisión específica de citosina (específica de C), e incorporando dCTP cuando se desea la escisión específica de uracilo (específica de U). Los fragmentos escindidos pueden luego analizarse por MALDI-TOF . El tratamiento con bisulfito produce la introducción o eliminación de sitios de escisión mediante conversiones de C a U, o bien un cambio en la masa de los fragmentos mediante conversiones de G a A en la cadena inversa amplificada. La escisión específica de C cortará específicamente en todos los sitios CpG metilados . Al analizar el tamaño de los fragmentos resultantes, es posible determinar el patrón específico de metilación del ADN en los sitios CpG dentro de la región, en lugar de determinar el grado de metilación de la región en su conjunto. Este método demostró su eficacia para el cribado de alto rendimiento , permitiendo el análisis de numerosos sitios CpG en múltiples tejidos de forma rentable.

PCR específica de metilación (MSP)

Figura 4: La PCR específica para metilación es un método sensible para amplificar y detectar selectivamente una región metilada de interés utilizando cebadores específicos para metilación en ADN genómico tratado con bisulfito. Estos cebadores se unen únicamente a secuencias metiladas, que contienen 5-metilcitosinas resistentes a la conversión por bisulfito. Como alternativa, se pueden utilizar cebadores específicos para regiones no metiladas.

Este método alternativo de análisis de metilación también utiliza ADN tratado con bisulfito, pero evita la necesidad de secuenciar el área de interés. [ 16 ] En cambio, los pares de cebadores se diseñan para ser "específicos para metilación" al incluir secuencias que complementan solo las 5-metilcitosinas no convertidas o, por el contrario, "específicos para no metilación", complementando las timinas convertidas a partir de citosinas no metiladas. La metilación se determina por la capacidad del cebador específico para lograr la amplificación. Este método es particularmente útil para investigar islas CpG con una densidad de metilación posiblemente alta, ya que un mayor número de pares CpG en el cebador aumenta la especificidad del ensayo. Colocar el par CpG en el extremo 3' del cebador también mejora la sensibilidad. El informe inicial que utilizó MSP describió una sensibilidad suficiente para detectar la metilación del 0,1% de los alelos . En general, MSP y sus protocolos relacionados se consideran los más sensibles al investigar el estado de metilación en un locus específico .

El método MethyLight se basa en MSP, pero proporciona un análisis cuantitativo mediante PCR cuantitativa . [ 17 ] Se utilizan cebadores específicos para metilación, así como una sonda fluorescente reportera específica para metilación que se une a la región amplificada. Alternativamente, los cebadores o la sonda pueden diseñarse sin especificidad de metilación si se requiere discriminación entre los pares CpG dentro de las secuencias involucradas. La cuantificación se realiza en referencia a un ADN de referencia metilado. Una modificación de este protocolo para aumentar la especificidad de la PCR para ADN convertido con éxito con bisulfito (ConLight-MSP) utiliza una sonda adicional para ADN no convertido con bisulfito para cuantificar esta amplificación no específica. [ 18 ]

La metodología adicional que utiliza ADN amplificado por MSP analiza los productos mediante análisis de curva de fusión (Mc-MSP). [ 19 ] Este método amplifica el ADN convertido con bisulfito con cebadores específicos para metilación y no metilación, y determina la proporción cuantitativa de los dos productos comparando los picos diferenciales generados en un análisis de curva de fusión. Se ha introducido un método de análisis de fusión de alta resolución que utiliza tanto PCR cuantitativa como análisis de fusión, en particular, para la detección sensible de metilación de bajo nivel. [ 20 ]

Métodos basados ​​en microarrays

Los métodos basados ​​en microarrays son una extensión lógica de las tecnologías disponibles para analizar ADN tratado con bisulfito, lo que permite el análisis de metilación a nivel genómico. [ 21 ] Los microarrays de oligonucleótidos se diseñan utilizando pares de sondas de hibridación de oligonucleótidos dirigidas a sitios CpG de interés. Una es complementaria a la secuencia metilada no alterada, y la otra es complementaria a la secuencia no metilada convertida de C a U. Las sondas también son específicas para bisulfito para evitar la unión al ADN convertido incompletamente por bisulfito. El ensayo de metilación de Illumina es un ejemplo de este tipo de ensayo que aplica la tecnología de secuenciación de bisulfito a nivel de microarray para generar datos de metilación a nivel genómico.

Limitaciones

5-hidroximetilcitosina

La secuenciación con bisulfito se utiliza ampliamente en genomas de mamíferos; sin embargo, han surgido complicaciones con el descubrimiento de una nueva modificación del ADN de mamíferos: la 5-hidroximetilcitosina . [ 22 ] [ 23 ] La 5-hidroximetilcitosina se convierte en citosina-5-metilsulfonato tras el tratamiento con bisulfito, que se lee como una C al ser secuenciada. [ 24 ] Por lo tanto, la secuenciación con bisulfito no puede distinguir entre 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina. Esto significa que el resultado de la secuenciación con bisulfito ya no puede definirse únicamente como metilación del ADN, puesto que es la combinación de 5-metilcitosina y 5-hidroximetilcitosina.

Conversión incompleta

La secuenciación con bisulfito se basa en la conversión de cada residuo de citosina no metilada a uracilo. Si la conversión es incompleta, el análisis posterior interpretará erróneamente las citosinas no metiladas no convertidas como citosinas metiladas, lo que dará lugar a falsos positivos de metilación. Solo las citosinas en el ADN monocatenario son susceptibles al ataque del bisulfito; por lo tanto, la desnaturalización del ADN que se analiza es fundamental. [ 2 ] Es importante asegurar que los parámetros de reacción, como la temperatura y la concentración de sal, sean adecuados para mantener el ADN en una conformación monocatenaria y permitir una conversión completa. Se ha informado que la inclusión del ADN en gel de agarosa mejora la velocidad de conversión al mantener las hebras de ADN físicamente separadas. [ 25 ] Las tasas de conversión incompletas pueden estimarse y ajustarse después de la secuenciación incluyendo un control interno en la biblioteca de secuenciación, como el ADN del fago lambda (que se sabe que no está metilado) o alineando las lecturas de secuenciación de bisulfito con una región no metilada conocida en el organismo, como el genoma del cloroplasto. [ 26 ]

Degradación del ADN durante el tratamiento con bisulfito.

Un desafío importante en la secuenciación con bisulfito es la degradación del ADN que ocurre simultáneamente con la conversión. Las condiciones necesarias para una conversión completa, como tiempos de incubación prolongados, temperatura elevada y alta concentración de bisulfito, pueden provocar la degradación de aproximadamente el 90 % del ADN incubado. [ 27 ] Dado que la cantidad inicial de ADN suele ser limitada, esta degradación extensa puede ser problemática. La degradación se produce como despurinaciones que dan lugar a roturas aleatorias de la cadena. [ 28 ] Por lo tanto, cuanto más largo sea el amplicón de PCR deseado , menor será probablemente el número de moléculas de plantilla intactas. Esto podría provocar el fallo de la amplificación por PCR o la pérdida de información cuantitativamente precisa sobre los niveles de metilación debido al muestreo limitado de moléculas de plantilla. Por consiguiente, es importante evaluar la cantidad de degradación del ADN resultante de las condiciones de reacción empleadas y considerar cómo afectará esto al amplicón deseado . También se pueden utilizar técnicas para minimizar la degradación del ADN, como el ciclo de la temperatura de incubación. [ 28 ]

En 2020, New England Biolabs desarrolló NEBNext Enzymatic Methyl-seq, un método enzimático alternativo para minimizar el daño al ADN. En lugar de bisulfito, se utiliza APOBEC para convertir C en U. La distinción entre C, 5mC y 5hmC se logra mediante modificaciones adicionales que "protegen" las bases modificadas de APOBEC. [ 29 ] [ 30 ]

Otras preocupaciones

Un problema potencialmente significativo tras el tratamiento con bisulfito es la desulfonación incompleta de los residuos de pirimidina debido a una alcalinización insuficiente de la solución. Esto puede inhibir algunas ADN polimerasas , dificultando la PCR posterior. Sin embargo, esta situación puede evitarse controlando el pH de la solución para asegurar una desulfonación completa. [ 2 ]

Una preocupación final es que el tratamiento con bisulfito reduce considerablemente el nivel de complejidad de la muestra, lo que puede ser problemático si se van a realizar múltiples reacciones de PCR (2006). [ 5 ] El diseño de los cebadores es más difícil y la hibridación cruzada inapropiada es más frecuente.

Aplicaciones: análisis de metilación a nivel genómico

Los avances en la secuenciación con bisulfito han permitido su aplicación a escala genómica , donde, anteriormente, la medición global de la metilación del ADN solo era factible mediante otras técnicas, como el escaneo genómico de marcadores de restricción . Muchos científicos consideran que el mapeo del epigenoma humano es la continuación lógica de la finalización del Proyecto Genoma Humano . [ 31 ] [ 32 ] Esta información epigenómica será importante para comprender cómo se implementa y regula la función de la secuencia genética. Dado que el epigenoma es menos estable que el genoma, se cree que es importante en las interacciones gen-ambiente . [ 33 ]

El mapeo epigenómico es intrínsecamente más complejo que la secuenciación del genoma , ya que el epigenoma es mucho más variable que el genoma . El epigenoma varía con la edad, difiere entre tejidos, se ve alterado por factores ambientales y presenta aberraciones en enfermedades. Sin embargo, un mapeo epigenómico tan completo, que represente diferentes edades, tipos de tejido y estados patológicos, proporcionaría información valiosa sobre la función normal de las marcas epigenéticas , así como sobre los mecanismos que conducen al envejecimiento y la enfermedad.

Entre los beneficios directos del mapeo epigenómico se incluyen los probables avances en la tecnología de clonación . Se cree que los fallos en la producción de animales clonados con viabilidad y esperanza de vida normales se deben a patrones inadecuados de marcas epigenéticas. Además, los patrones de metilación aberrantes están bien caracterizados en muchos tipos de cáncer . La hipometilación global produce una disminución de la estabilidad genómica, mientras que la hipermetilación local de los promotores de genes supresores de tumores suele explicar su pérdida de función . Los patrones específicos de metilación son indicativos de tipos específicos de cáncer, tienen valor pronóstico y pueden ayudar a orientar el mejor curso de tratamiento. [ 32 ]

En todo el mundo se están llevando a cabo proyectos de mapeo epigenómico a gran escala, organizados bajo el Proyecto Epigenoma Humano . [ 33 ] Este proyecto se basa en una estrategia de múltiples niveles, en la que se utiliza la secuenciación con bisulfito para obtener perfiles de metilación de alta resolución para un número limitado de epigenomas de referencia, mientras que se realiza un análisis menos exhaustivo en un espectro más amplio de muestras. Este enfoque busca maximizar el conocimiento obtenido con una cantidad determinada de recursos, dado que el mapeo genómico de alta resolución sigue siendo una tarea costosa.

Se ha demostrado que el análisis de conjuntos de genes (por ejemplo, utilizando herramientas como DAVID y GoSeq) está gravemente sesgado cuando se aplica a datos de metilación de alto rendimiento (por ejemplo, secuenciación de bisulfito de todo el genoma); se ha sugerido que esto puede corregirse utilizando permutaciones de etiquetas de muestras o utilizando un modelo estadístico para controlar las diferencias en el número de sondas CpG / sitios CpG que se dirigen a cada gen. [ 34 ]

Secuenciación oxidativa con bisulfito

La 5-metilcitosina y la 5-hidroximetilcitosina se leen como una C en la secuenciación con bisulfito. [ 24 ] En la secuenciación oxidativa con bisulfito (oxBS), se utiliza Tet para convertir la 5-hidroximetilcitosina en 5-formilcitosina, que posteriormente se convierte en uracilo durante el tratamiento con bisulfito. [ 35 ] La única base que se lee entonces como una C es la 5-metilcitosina, lo que proporciona un mapa del estado de metilación real en la muestra de ADN. Los niveles de 5-hidroximetilcitosina también se pueden cuantificar midiendo la diferencia entre la secuenciación con bisulfito y la secuenciación oxidativa con bisulfito.

Otro método, la secuenciación oxidativa con bisulfito asistida por Tet (TAB-Seq), desarrollada por Chuan He en la Universidad de Chicago, convierte las bases de manera diferente: 5hmC se lee como C, mientras que 5mC y C se leen como T. Para lograr esto, las bases 5hmC se "protegen" primero mediante su conversión a β-glucosil-5-hidroximetilcitosina (5gmC). Se introduce la enzima Tet para convertir todo el 5mC en 5caC. El bisulfito luego convierte tanto C como 5caC en uracilo. 5gmC se leerá como C en la amplificación por PCR. [ 36 ]

Véase también

Referencias

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  • Protocolo de conversión de bisulfito
  • Proyecto Epigenoma Humano (HEP) - Datos — del Instituto Sanger
  • La Red de Excelencia del Epigenoma
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