Cianina

Las cianinas, también conocidas como tetrametilindo(di)-carbocianinas ^{[ 1 ],} son una familia de colorantes sintéticos pertenecientes al grupo de colorantes polimetínicos . Aunque el nombre deriva etimológicamente de términos para tonos de azul , la familia de las cianinas abarca el espectro electromagnético desde el infrarrojo cercano hasta el ultravioleta .

Químicamente, las cianinas son un sistema conjugado entre dos átomos de nitrógeno ; en cada estructura de resonancia , exactamente un átomo de nitrógeno se oxida a un iminio . Típicamente, forman parte de un sistema heterocíclico nitrogenado . ^{[ 2 ]}

La principal aplicación de los colorantes de cianina es el marcaje biológico . No obstante, existe una amplia bibliografía sobre su síntesis y usos, y las cianinas son comunes en algunos soportes de CD y DVD .

Las cianinas se han clasificado de muchas maneras: ^{[ 3 ]}

• Estreptocianinas o cianinas de cadena abierta :

R ₂ N ⁺ =CH[CH=CH] _n -NR ₂ (I)

• Hemicianinas :

Arilo=N ⁺ =CH[CH=CH] _n -NR ₂ (II)

• Cianinas de cadena cerrada :

Arilo=N ⁺ =CH[CH=CH] _n -N=Arilo (III)

Además, se reconocen estas clases: ^{[ 4 ]}

• Neutrocianinas :

R ₂ N ⁺ =CH[CH=CH] _n -CN y R2N ₊ = ^CH [CH=CH] _n -CHO

• Merocianinas, incluyendo espiropiranos y quinoftalonas .
• Apocianinas

donde dos nitrógenos cuaternarios están unidos por una cadena polimetina . ^{[ 5 ]} Ambos nitrógenos pueden ser parte independientemente de una fracción heteroaromática , como pirrol , imidazol , tiazol , piridina , quinolina , indol , benzotiazol , etc. Además, la cadena polimetina de las cianinas puede tener varios sustituyentes que permiten la modulación de las propiedades espectrales y aportan una funcionalidad adicional, ^{[ 6 ]} y esta característica puede predecirse racionalmente. ^{[ 7 ]}

Los colorantes de cianina de cadena larga tienen una estructura relativamente frágil. Los colorantes de cianina heptametínica pueden sufrir una truncación térmica espontánea a cianinas pentametínicas, y estas últimas son capaces de una descomposición similar en presencia de una base amínica a cianinas trimetínicas. ^{[ 8 ] [ 9 ]}

Las cianinas se sintetizaron por primera vez hace más de un siglo utilizando ingredientes destilados del alquitrán de hulla . Los componentes principales eran la quinolina y la lepidina (4-metilquinolina).: ^{[ 4 ]}

Originalmente se usaban, y todavía se usan, para aumentar el rango de sensibilidad de las emulsiones fotográficas , es decir, para aumentar el rango de longitudes de onda que formarán una imagen en la película, haciendo que la película sea pancromática . ^{[ 4 ]} Las cianinas también se usan en los medios CD-R y DVD-R . Las que se usan son principalmente de color verde o azul claro, y son químicamente inestables. Por esa razón, los discos de cianina no estabilizados no son adecuados para el uso de CD y DVD de archivo. Los discos de cianina recientes contienen estabilizadores, típicamente un átomo de metal unido a la molécula de cianina, ^{[ 10 ]} que ralentizan significativamente el deterioro. Estos discos a menudo se clasifican con una vida de archivo de 75 años o más. Los otros tintes utilizados en los CD-R son la ftalocianina y el azo .

Debido a que producen una fluorescencia más brillante y estable, las cianinas pueden reemplazar ventajosamente a los colorantes convencionales como la fluoresceína y las rodamina .

• Cy3 y Cy5 son los más populares, y normalmente se utilizan combinados para la detección de 2 colores.

Cy3 fluoresce en amarillo verdoso (excitación de ~550 nm , emisión de ~570  nm), mientras que Cy5 es fluorescente en la región del rojo lejano (excitación de ~650 nm,  emisión de 670 nm). ^{[ 17 ]} Cy3 puede ser detectado por varios fluorómetros, sistemas de imagen y microscopios con filtros estándar para tetrametilrodamina (TRITC). Debido a su alto coeficiente de extinción molar , este colorante también es fácilmente detectable a simple vista en geles de electroforesis y en solución. Cy5 se convirtió en un reemplazo popular para los colorantes fluorescentes del rojo lejano debido a su alto coeficiente de extinción (tan pequeño como 1 nanomol puede ser detectado en electroforesis en gel a simple vista) y su máximo de emisión de fluoróforo en la región roja, donde muchos detectores CCD tienen máxima sensibilidad y los objetos biológicos dan baja interferencia de fondo.

Los escáneres utilizan diversas longitudes de onda de emisión láser (normalmente 532 nm y 635 nm ) y longitudes de onda de filtro (550-600 nm y 655-695 nm ) para evitar la contaminación de fondo. De este modo, pueden distinguir fácilmente los colores de Cy3 y Cy5, y también cuantificar la cantidad de marcaje con Cy3 y Cy5 en una misma muestra (detección multiparamétrica).

• Otros colorantes de cianina también son útiles:

Cy3.5 puede reemplazar a la sulforodamina 101.

Cy5.5 es un colorante que emite fluorescencia en el infrarrojo cercano (IR) (máximo de excitación/emisión de 678/694  nm).

Cy7 es un fluoróforo de infrarrojo cercano invisible a simple vista (excitación/emisión máxima de 750/776  nm). Se utiliza en aplicaciones de imagenología in vivo , al igual que el colorante Cy7.5.

Los colorantes de sulfocianina poseen uno o dos grupos sulfo, lo que hace que el colorante Cy sea soluble en agua, pero existen formas tri- y tetrasulfonadas para una solubilidad en agua aún mayor. ^{[ 13 ]} La PEGilación es otra modificación que confiere hidrofilicidad, no solo al colorante sino también al conjugado marcado.

Aplicaciones

Los colorantes de cianina se utilizan para marcar proteínas, anticuerpos, péptidos, sondas de ácidos nucleicos y cualquier otro tipo de biomoléculas que se emplean en diversas técnicas de detección por fluorescencia: citometría de flujo , microscopía (principalmente en el rango visible, pero también UV e IR ), ensayos en microplacas, microarrays , así como "sondas luminiscentes" e imágenes in vivo. ^{[ 23 ]}

Marcaje de ácidos nucleicos

En los experimentos de microarrays, el ADN o el ARN se marcan con Cy3 o Cy5, que se sintetizan para portar un grupo reactivo éster de N-hidroxisuccinimidilo ( NHS- éster). Dado que los NHS-ésteres reaccionan fácilmente solo con grupos amina alifáticos , de los que carecen los ácidos nucleicos, los nucleótidos deben modificarse con grupos aminoalilo . Esto se logra incorporando nucleótidos modificados con aminoalilo durante las reacciones de síntesis. Una buena proporción es una marca cada 60 bases, de manera que las marcas no estén demasiado cerca entre sí, lo que provocaría efectos de extinción de la fluorescencia .

Marcaje de proteínas

Para el marcaje de proteínas, los colorantes Cy3 y Cy5 a veces llevan un grupo succinimidilo para reaccionar con aminas, o un grupo maleimida para reaccionar con un grupo sulfhidrilo de los residuos de cisteína .

El Cy5 es sensible a su entorno electrónico. Los cambios en la conformación de la proteína a la que está unido producen un aumento o una disminución de la emisión. La velocidad de este cambio se puede medir para determinar los parámetros cinéticos de la enzima. Estos colorantes se pueden utilizar con fines similares en experimentos FRET.

Cy3 y Cy5 se utilizan en experimentos de proteómica para mezclar muestras de dos fuentes y procesarlas conjuntamente mediante separación. ^{[ 24 ] [ 25 ]} Esto elimina las variaciones debidas a las diferentes condiciones experimentales, inevitables si las muestras se procesaran por separado. Estas variaciones dificultan enormemente, si no imposibilitan, la automatización de la adquisición de datos mediante ordenadores una vez completada la separación. El uso de estos colorantes simplifica enormemente la automatización.

La palabra cianina proviene de la palabra inglesa "cyan", que convencionalmente significa un tono de azul verdoso (cercano al "aguamarina") y se deriva del griego κυάνεος / κυανοῦς kyaneos/kyanous , que significa un color algo diferente: "azul oscuro".