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ADN ligasa

La ADN ligasa es un tipo de enzima que facilita la unión de las hebras de ADN catalizando la formación de un enlace fosfodiéster . Desempeña un papel en la reparación de roturas...

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La ADN ligasa es un tipo de enzima que facilita la unión de las hebras de ADN catalizando la formación de un enlace fosfodiéster . Desempeña un papel en la reparación de roturas de una sola hebra en el ADN bicatenario de los organismos vivos, pero algunas formas (como la ADN ligasa IV ) pueden reparar específicamente roturas de doble hebra (es decir, una rotura en ambas hebras complementarias del ADN). Las roturas de una sola hebra son reparadas por la ADN ligasa utilizando la hebra complementaria de la doble hélice como plantilla, [ 1 ] y la ADN ligasa crea el enlace fosfodiéster final para reparar completamente el ADN.

La ADN ligasa se utiliza tanto en la reparación como en la replicación del ADN (véase Ligasas de mamíferos ). Además, la ADN ligasa se utiliza ampliamente en laboratorios de biología molecular para experimentos con ADN recombinante (véase Aplicaciones en investigación ). La ADN ligasa purificada se utiliza en la clonación de genes para unir moléculas de ADN y formar ADN recombinante .

Mecanismo enzimático

La imagen muestra cómo la ligasa (óvalo amarillo) cataliza la unión de dos fragmentos de ADN. La ligasa une los dos fragmentos de ADN para formar una cadena más larga, mediante un proceso de "unión".

El mecanismo de la ADN ligasa consiste en formar dos enlaces fosfodiéster covalentes entre los extremos hidroxilo 3' de un nucleótido ("aceptor") y el extremo fosfato 5' de otro ("donador"). Se consumen dos moléculas de ATP por cada enlace fosfodiéster formado. [ 2 ] El AMP es necesario para la reacción de la ligasa, que se desarrolla en cuatro pasos:

  1. Reorganización del sitio de actividad, como muescas en segmentos de ADN o fragmentos de Okazaki, etc.
  2. La adenililación (adición de AMP) de un residuo de lisina en el centro activo de la enzima libera pirofosfato ;
  3. Transferencia del AMP al fosfato 5' del llamado donador, formación de un enlace pirofosfato;
  4. Formación de un enlace fosfodiéster entre el fosfato 5' del donador y el hidroxilo 3' del aceptor. [ 3 ]
Un ejemplo ilustrado de cómo funciona una ligasa (con extremos cohesivos ).

La ligasa también funciona con extremos romos , aunque se requieren concentraciones de enzima más altas y condiciones de reacción diferentes.

Tipos

E. coli

La ADN ligasa de E. coli está codificada por el gen lig . La ADN ligasa en E. coli , al igual que en la mayoría de los procariotas, utiliza la energía obtenida al escindir el dinucleótido de nicotinamida y adenina (NAD) para crear el enlace fosfodiéster. [ 4 ] No liga ADN de extremos romos excepto en condiciones de alta concentración molecular con polietilenglicol , y no puede unir ARN a ADN de manera eficiente. [ 5 ]

La actividad de la ADN ligasa de E. coli puede potenciarse mediante la ADN polimerasa en las concentraciones adecuadas. Esta potenciación solo funciona cuando las concentraciones de la ADN polimerasa I son mucho menores que los fragmentos de ADN que se van a ligar. Cuando las concentraciones de la ADN polimerasa Pol I son mayores, se produce un efecto adverso sobre la ADN ligasa de E. coli [ 6 ].

T4

La ADN ligasa del bacteriófago T4 (un bacteriófago que infecta la bacteria Escherichia coli ). La ligasa T4 es la más utilizada en la investigación de laboratorio. [ 7 ] Puede ligar extremos cohesivos o romos de ADN, oligonucleótidos, así como ARN e híbridos de ARN-ADN, pero no ácidos nucleicos monocatenarios. También puede ligar ADN de extremos romos con mucha mayor eficiencia que la ADN ligasa de E. coli . A diferencia de la ADN ligasa de E. coli , la ADN ligasa T4 no puede utilizar NAD y requiere absolutamente ATP como cofactor. Se han realizado algunas modificaciones genéticas para mejorar la actividad in vitro de la ADN ligasa T4; un enfoque exitoso, por ejemplo, probó la ADN ligasa T4 fusionada a varias proteínas de unión al ADN alternativas y encontró que los constructos con p50 o NF-kB como socios de fusión eran más de un 160 % más activos en ligaciones de extremos romos para fines de clonación que la ADN ligasa T4 de tipo silvestre. [ 8 ] Una reacción típica para insertar un fragmento en un vector plasmídico utilizaría aproximadamente de 0,01 (extremos cohesivos) a 1 (extremos romos) unidades de ligasa. La temperatura de incubación óptima para la ADN ligasa T4 es de 37  °C, temperatura a la que las enzimas T4 son más activas. Sin embargo, no es raro realizar reacciones de ligación a 16  °C, una temperatura intermedia en la que la ligasa es activa y adecuada para el apareamiento de bases de los extremos cohesivos. [ 9 ]

Los mutantes de la ligasa del bacteriófago T4 tienen una mayor sensibilidad tanto a la irradiación UV [ 10 ] [ 11 ] como al agente alquilante metil metanosulfonato [ 12 ] lo que indica que la ligasa de ADN se emplea en la reparación de los daños en el ADN causados ​​por estos agentes.

Mamífero

En los mamíferos, existen cuatro tipos específicos de ligasa.

  1. Ligasa de ADN 1 : liga el ADN naciente de la hebra rezagada después de que la ribonucleasa H haya eliminado el cebador de ARN de los fragmentos de Okazaki .
  2. La ADN ligasa 3 forma complejos con la proteína de reparación del ADN XRCC1 para ayudar a sellar el ADN durante el proceso de reparación por escisión de nucleótidos y la formación de fragmentos recombinantes. De todas las ADN ligasas de mamíferos conocidas, solo la ligasa 3 se ha encontrado en las mitocondrias.
  3. La ADN ligasa 4 forma complejos con XRCC4 . Cataliza el paso final de la vía de reparación de roturas de doble cadena de ADN mediante unión de extremos no homólogos . También es necesaria para la recombinación V(D)J , proceso que genera diversidad en los loci de inmunoglobulinas y receptores de células T durante el desarrollo del sistema inmunitario .
  • ADN ligasa 2: Un artefacto de purificación resultante de la degradación proteolítica de la ADN ligasa 3. Inicialmente, se la reconoció como otra ADN ligasa, lo que explica la nomenclatura inusual de las ADN ligasas. [ 13 ]

La ADN ligasa de eucariotas y algunos microbios utiliza trifosfato de adenosina (ATP) en lugar de NAD. [ 4 ]

Termoestable

Derivada de una bacteria termófila, la enzima es estable y activa a temperaturas mucho más elevadas que las ADN ligasas convencionales. Su vida media es de 48 horas a 65  °C y superior a 1  hora a 95  °C. Se ha demostrado que la ADN ligasa Ampligase es activa durante al menos 500 ciclos térmicos (94  °C/80  °C) o 16 horas de ciclado.<sup> 10  </sup> Esta excepcional termoestabilidad permite una especificidad de hibridación y ligación extremadamente altas. <sup> 14 </sup>

Medición de la actividad

Existen al menos tres unidades diferentes que se utilizan para medir la actividad de la ADN ligasa: [ 15 ]

  • Weiss unit - the amount of ligase that catalyzes the exchange of 1 nmole of 32P from inorganic pyrophosphate to ATP in 20 minutes at 37°C. This is the one most commonly used.
  • Modrich-Lehman unit - this is rarely used, and one unit is defined as the amount of enzyme required to convert 100 nmoles of d(A-T)n to an exonuclease-III resistant form in 30 minutes under standard conditions.
  • Many commercial suppliers of ligases use an arbitrary unit based on the ability of ligase to ligate cohesive ends. These units are often more subjective than quantitative and lack precision.

Research applications

DNA ligases have become indispensable tools in modern molecular biology research for generating recombinant DNA sequences. For example, DNA ligases are used with restriction enzymes to insert DNA fragments, often genes, into plasmids.

Controlling the optimal temperature is a vital aspect of performing efficient recombination experiments involving the ligation of cohesive-ended fragments. Most experiments use T4 DNA Ligase (isolated from bacteriophage T4), which is most active at 37 °C.[16] However, for optimal ligation efficiency with cohesive-ended fragments ("sticky ends"), the optimal enzyme temperature needs to be balanced with the melting temperature Tm of the sticky ends being ligated,[17] the homologous pairing of the sticky ends will not be stable because the high temperature disrupts hydrogen bonding. A ligation reaction is most efficient when the sticky ends are already stably annealed, and disruption of the annealing ends would therefore result in low ligation efficiency. The shorter the overhang, the lower the Tm.

Since blunt-ended DNA fragments have no cohesive ends to anneal, the melting temperature is not a factor to consider within the normal temperature range of the ligation reaction. The limiting factor in blunt end ligation is not the activity of the ligase but rather the number of alignments between DNA fragment ends that occur. The most efficient ligation temperature for blunt-ended DNA would therefore be the temperature at which the greatest number of alignments can occur. The majority of blunt-ended ligations are carried out at 14-25 °C overnight. The absence of stably annealed ends also means that the ligation efficiency is lowered, requiring a higher ligase concentration to be used.[17]

Un uso novedoso de la ADN ligasa se observa en el campo de la nanoquímica, específicamente en el ADN origami.  Los principios de autoensamblaje basados ​​en ADN han demostrado ser útiles para organizar objetos a nanoescala, como biomoléculas, nanomáquinas y componentes nanoelectrónicos y fotónicos. El ensamblaje de dichas nanoestructuras requiere la creación de una intrincada red de moléculas de ADN. Si bien el autoensamblaje de ADN es posible sin ayuda externa utilizando diferentes sustratos, como la superficie catatónica de una lámina de aluminio, la ADN ligasa puede proporcionar la asistencia enzimática necesaria para formar la estructura reticular del ADN a partir de los extremos sobresalientes. [ 18 ]

Historia

La primera ADN ligasa fue purificada y caracterizada en 1967 por los laboratorios de Gellert, Lehman, Richardson y Hurwitz. [ 19 ] Fue purificada y caracterizada por primera vez por Weiss y Richardson utilizando un proceso de fraccionamiento cromatográfico de seis pasos que comenzó con la eliminación de restos celulares y la adición de estreptomicina, seguido de varios lavados con columna de dietilaminoetil (DEAE)-celulosa y un fraccionamiento final con fosfocelulosa. El extracto final contenía el 10% de la actividad registrada inicialmente en el medio de E. coli ; durante el proceso se descubrió que el ATP y el Mg++ eran necesarios para optimizar la reacción. Las ADN ligasas comunes disponibles comercialmente fueron descubiertas originalmente en el bacteriófago T4 , E. coli y otras bacterias . [ 20 ]  

Trastornos

Las deficiencias genéticas en las ADN ligasas humanas se han asociado con síndromes clínicos caracterizados por inmunodeficiencia, sensibilidad a la radiación y anomalías del desarrollo, [ 19 ] El síndrome LIG4 (síndrome de ligasa IV) es una enfermedad rara asociada con mutaciones en la ADN ligasa 4 e interfiere con los mecanismos de reparación de roturas de ADN bicatenario. El síndrome de ligasa IV causa inmunodeficiencia en individuos y se asocia comúnmente con microcefalia e hipoplasia de la médula ósea. [ 21 ] A continuación se presenta una lista de enfermedades prevalentes causadas por la falta o el mal funcionamiento de la ADN ligasa. 

Xeroderma pigmentoso

El xeroderma pigmentoso , comúnmente conocido como XP, es una enfermedad hereditaria caracterizada por una sensibilidad extrema a los rayos ultravioleta (UV) de la luz solar. Esta enfermedad afecta principalmente a los ojos y a las zonas de la piel expuestas al sol. Algunas personas afectadas también presentan problemas en el sistema nervioso. [ 22 ]

Ataxia-telangiectasia

Las mutaciones en el gen  ATM causan ataxia-telangiectasia . El gen ATM proporciona las instrucciones para la producción de una proteína que ayuda a controlar la división celular y participa en la reparación del ADN. Esta proteína desempeña un papel importante en el desarrollo y la actividad normales de varios sistemas corporales, incluidos el sistema nervioso y el sistema inmunitario. La proteína ATM ayuda a las células a reconocer las hebras de ADN dañadas o rotas y coordina la reparación del ADN activando enzimas que las reparan. La reparación eficiente de las hebras de ADN dañadas ayuda a mantener la estabilidad de la información genética de la célula. Los niños afectados suelen presentar dificultad para caminar, problemas de equilibrio y coordinación de las manos, movimientos involuntarios (corea), espasmos musculares (mioclonías) y alteraciones en la función nerviosa (neuropatía). Los problemas de movimiento suelen hacer que las personas necesiten una silla de ruedas en la adolescencia. Las personas con este trastorno también presentan dificultad para hablar y problemas para mover los ojos de lado a lado (apraxia oculomotora). [ 23 ]       

Anemia de Fanconi

La anemia de Fanconi (AF) es un trastorno sanguíneo hereditario poco común que provoca insuficiencia de la médula ósea. La AF impide que la médula ósea produzca suficientes células sanguíneas nuevas para que el cuerpo funcione con normalidad. La AF también puede causar que la médula ósea produzca muchas células sanguíneas defectuosas. Esto puede provocar graves problemas de salud, como la leucemia . [ 24 ]

síndrome de Bloom

El síndrome de Bloom provoca sensibilidad en la piel a la exposición solar y, por lo general, la aparición de una mancha rojiza en forma de mariposa en la nariz y las mejillas. También puede aparecer una erupción cutánea en otras zonas expuestas al sol, como el dorso de las manos y los antebrazos. Es frecuente observar pequeñas agrupaciones de vasos sanguíneos dilatados (telangiectasias), que también pueden aparecer en los ojos. Otras características cutáneas incluyen manchas de piel más claras o más oscuras que las zonas circundantes (hipopigmentación o hiperpigmentación, respectivamente). Estas manchas aparecen en zonas de la piel no expuestas al sol y su desarrollo no está relacionado con las erupciones.

Como objetivo farmacológico

En estudios recientes, la ADN ligasa I humana se utilizó en el diseño de fármacos asistido por computadora para identificar inhibidores de la ADN ligasa como posibles agentes terapéuticos para tratar el cáncer. [ 25 ] Dado que el crecimiento celular excesivo es un sello distintivo del desarrollo del cáncer, la quimioterapia dirigida que interrumpe el funcionamiento de la ADN ligasa puede impedir las formas adyuvantes del cáncer. Además, se ha demostrado que las ADN ligasas se pueden dividir en dos categorías principales: dependientes de ATP y dependientes de NAD + . Investigaciones previas han demostrado que, si bien se han descubierto ADN ligasas dependientes de NAD + en nichos celulares o virales esporádicos fuera del dominio bacteriano de la vida, no existe ningún caso en el que una ligasa dependiente de NAD + esté presente en un organismo eucariota . La presencia exclusiva en organismos no eucariotas, la especificidad de sustrato única y la estructura de dominio distintiva de las ADN ligasas humanas dependientes de NAD+ en comparación con las dependientes de ATP hacen que las ligasas dependientes de NAD + sean objetivos ideales para el desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos. [ 19 ]

Véase también

Referencias

  1. ↑ Pascal JM, O'Brien PJ, Tomkinson AE, Ellenberger T (noviembre de 2004). "La ADN ligasa I humana rodea completamente y desenrolla parcialmente el ADN con muescas". Nature . 432 ( 7016): 473–8 . Bibcode : 2004Natur.432..473P . doi : 10.1038/nature03082 . PMID 15565146. S2CID 3105417 .  
  2. ↑ Sharma, Babita (2023-08-03). "ADN ligasa: definición, estructura, tipos, funciones" . microbenotes.com . Consultado el 2026-01-07 .
  3. ↑ Lehman IR (noviembre de 1974). "ADN ligasa: estructura, mecanismo y función". Science . 186 (4166): 790– 7. Bibcode : 1974Sci...186..790L . doi : 10.1126/science.186.4166.790 . PMID 4377758. S2CID 86549159 .  
  4. 1 2 Foster JB, Slonczewski J (2010). Microbiología: Una ciencia en evolución (Segunda edición). Nueva York: WW Norton & Company. ISBN  978-0-393-93447-2.
  5. ↑ "Enzimas utilizadas en biología molecular: una guía útil" . PubMed Central . Consultado el 17 de junio de 2026 .
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  7. ↑ "Ligasas" (PDF) . Guía de recursos enzimáticos . Promega Corporation. págs. 8–14 . 
  8. ↑ Wilson RH, Morton SK, Deiderick H, Gerth ML, Paul HA, Gerber I, Patel A, Ellington AD, Hunicke-Smith SP, Patrick WM (julio de 2013). "Ligasas de ADN modificadas con actividades mejoradas in vitro" . Protein Engineering, Design & Selection . 26 (7): 471–8 . doi : 10.1093/protein/gzt024 . PMID 23754529 . 
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