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Ligación (biología molecular)

Una ligadura de extremo adhesivo La ligación es la unión de dos nucleótidos, o dos fragmentos de ácido nucleico, en una sola cadena polimérica mediante la acción de una enzima c...

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Una ligadura de extremo adhesivo

La ligación es la unión de dos nucleótidos, o dos fragmentos de ácido nucleico, en una sola cadena polimérica mediante la acción de una enzima conocida como ligasa . La reacción implica la formación de un enlace fosfodiéster entre el extremo 3'-hidroxilo de un nucleótido y el extremo 5'-fosforilo de otro nucleótido, lo que da como resultado que los dos nucleótidos se unan consecutivamente en una sola hebra. La ligación funciona fundamentalmente de la misma manera tanto para el ADN como para el ARN. Generalmente, en la reacción interviene un cofactor, usualmente ATP o NAD + . Las ligasas eucariotas pertenecen al tipo ATP, mientras que las del tipo NAD+ se encuentran en bacterias (por ejemplo, E. coli ). [ 1 ]

La ligación ocurre de forma natural como parte de numerosos procesos celulares, incluyendo la replicación , transcripción, empalme y recombinación del ADN, y también es un procedimiento de laboratorio esencial en la clonación molecular , mediante el cual se unen fragmentos de ADN para crear moléculas de ADN recombinante (como cuando se inserta un fragmento de ADN extraño en un plásmido ). El descubrimiento de la ADN ligasa data de 1967 y fue un evento importante en el campo de la biología molecular . [ 1 ] La ligación en el laboratorio se realiza normalmente utilizando la ADN ligasa T4 . Se utiliza ampliamente in vitro debido a su capacidad para unir fragmentos con extremos cohesivos, así como fragmentos con extremos romos. [ 2 ] Sin embargo, también son populares los procedimientos de ligación sin el uso de la ADN ligasa estándar. Las anomalías de la ADN ligasa humana se han relacionado con trastornos patológicos caracterizados por inmunodeficiencia, sensibilidad a la radiación y problemas del desarrollo. [ 3 ]

Reacción de ligación

El mecanismo de la reacción de ligación fue dilucidado por primera vez en el laboratorio de I. Robert Lehman. [ 4 ] [ 5 ] Dos fragmentos de ADN pueden unirse mediante la ADN ligasa , que cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo 3'-hidroxilo (-OH) en un extremo de una hebra de ADN y el grupo 5'-fosfato (-PO4) de la otra. En animales y bacteriófagos , el ATP se utiliza como fuente de energía para la ligación, mientras que en bacterias se utiliza NAD + . [ 6 ]

La ADN ligasa reacciona primero con ATP o NAD + , formando un intermedio ligasa-AMP con el AMP unido al grupo ε-amino de la lisina en el sitio activo de la ligasa mediante un enlace fosforamida. Este grupo adenililo se transfiere luego al grupo fosfato en el extremo 5' de una cadena de ADN, formando un complejo ADN-adenilato. Finalmente, se forma un enlace fosfodiéster entre los dos extremos del ADN mediante el ataque nucleofílico del 3'-hidroxilo en el extremo de una hebra de ADN sobre el grupo 5'-fosforilo activado de otra. [ 4 ]

Una muesca en el ADN (es decir, una rotura en una de las hebras de un ADN de doble cadena) puede ser reparada de manera muy eficiente por la ligasa. Sin embargo, se presenta una característica que complica la ligación cuando se ligan dos extremos de ADN separados, ya que ambos extremos deben unirse antes de que la reacción de ligación pueda proceder. En las reacciones de ligación realizadas en el laboratorio, la ligación de ADN con extremos cohesivos o pegajosos , las hebras sobresalientes del ADN pueden estar ya apareadas, por lo que es un proceso relativamente eficiente, ya que equivale a reparar dos muescas en el ADN. Sin embargo, en la ligación de extremos romos , que carecen de extremos sobresalientes para que el ADN se aparee, el proceso depende de colisiones aleatorias para que los extremos se alineen antes de que puedan ser ligados, y en consecuencia es un proceso mucho menos eficiente. [ 7 ] La ADN ligasa de E. coli no puede ligar ADN de extremos romos excepto en condiciones de hacinamiento molecular, y por lo tanto no se usa normalmente para la ligación en el laboratorio. En cambio, se utiliza la ADN ligasa del fago T4, ya que puede ligar tanto ADN de extremos romos como ADN monocatenario. [ 8 ] [ 6 ]

Factores que afectan a la ligadura

En el laboratorio, los factores que afectan una reacción química mediada por enzimas también afectan una reacción de ligación; estos incluyen la concentración de la enzima y los reactivos, la temperatura de reacción y el tiempo de incubación. La ligación se complica porque la reacción puede involucrar reacciones tanto intermoleculares como intramoleculares, pero los productos de ligación deseados en muchas reacciones de ligación (por ejemplo, la ligación de un fragmento de ADN a un vector) primero deben ser intermoleculares, es decir, entre dos moléculas de ADN diferentes, seguidos de una reacción intramolecular para sellar y circularizar la molécula. Para una ligación eficiente, también es necesario un paso de hibridación adicional.

Los tres pasos para formar un nuevo enlace fosfodiéster durante la ligación son: adenililación enzimática, transferencia de adenililo al ADN y sellado de la muesca. El Mg²⁺ es un cofactor para la catálisis; por lo tanto, a alta concentración de Mg²⁺, la eficiencia de la ligación es alta. Si la concentración de Mg²⁺ es limitada, el sellado de la muesca es la reacción limitante de la velocidad del proceso, y el intermedio de ADN adenililado permanece en la solución. Dicha adenililación de la enzima restringe la unión al intermedio de ADN adenililado, lo que constituye un punto débil de LIG1 y representa un riesgo si no se corrige. [ 9 ]

concentración de ADN

La concentración de ADN puede afectar la velocidad de ligación y si esta es una reacción intermolecular o intramolecular. La ligación implica la unión de los extremos de una molécula de ADN con otros extremos; sin embargo, cada fragmento de ADN tiene dos extremos, y si estos son compatibles, una molécula de ADN puede circularizarse uniendo sus propios extremos. A alta concentración de ADN, existe una mayor probabilidad de que un extremo de una molécula de ADN se encuentre con el extremo de otra, formando así una ligación intermolecular. A menor concentración de ADN, aumenta la probabilidad de que un extremo de una molécula de ADN se encuentre con el otro extremo de la misma molécula, por lo que es más probable que se produzca una reacción intramolecular que circularice el ADN. La eficiencia de transformación del ADN lineal también es mucho menor que la del ADN circular, y para que el ADN se circularice, su concentración no debe ser demasiado alta. Como regla general, la concentración total de ADN debe ser inferior a 10 μg/ml. [ 10 ]

La concentración relativa de los fragmentos de ADN, su longitud, así como las condiciones del tampón, son también factores que pueden influir en si se favorecen las reacciones intermoleculares o intramoleculares.

La concentración de ADN puede incrementarse artificialmente mediante la adición de agentes condensantes como la hexamina de cobalto y poliaminas biogénicas como la espermidina , o mediante el uso de agentes de hacinamiento como el polietilenglicol (PEG), que también incrementa la concentración efectiva de enzimas. [ 11 ] [ 12 ] Sin embargo, cabe señalar que aditivos como la hexamina de cobalto pueden producir exclusivamente reacciones intermoleculares, [ 11 ] dando como resultado concatémeros lineales en lugar del ADN circular más adecuado para la transformación de ADN plasmídico, y por lo tanto, no es deseable para la ligación de plásmidos. Si es necesario utilizar aditivos en la ligación de plásmidos, el uso de PEG es preferible, ya que puede promover tanto la ligación intramolecular como la intermolecular. [ 13 ]

concentración de ligasa

Como es habitual en las enzimas, cuanto mayor sea la concentración de ligasa, más rápida será la velocidad de ligación. La ligación de extremos romos es mucho menos eficiente que la ligación de extremos cohesivos, por lo que se utiliza una mayor concentración de ligasa en las ligaciones de extremos romos. Se puede utilizar una alta concentración de ligasa de ADN junto con PEG para una ligación más rápida, y estos son los componentes que se encuentran a menudo en los kits comerciales diseñados para la ligación rápida. [ 14 ] [ 15 ]

Temperatura

Al considerar la temperatura de una reacción de ligación, intervienen dos factores. Primero, la temperatura óptima para la actividad de la ADN ligasa, que es de 37 ° C, y segundo, la temperatura de fusión (Tm ) de los extremos del ADN que se van a ligar. La temperatura de fusión depende de la longitud y la composición de bases del extremo sobresaliente del ADN: cuanto mayor sea el número de G y C, mayor será la Tm, ya que se forman tres enlaces de hidrógeno entre pares de bases GC en comparación con dos para pares de bases AT, con cierta contribución del apilamiento de bases entre fragmentos. Para que la reacción de ligación se lleve a cabo de manera eficiente, los extremos deben estar hibridados de forma estable, y en los experimentos de ligación, la Tm de los extremos del ADN suele ser mucho menor que 37 ° C. Por lo tanto, la temperatura óptima para ligar extremos cohesivos es un compromiso entre la mejor temperatura para la actividad de la ADN ligasa y la Tm a la que los extremos pueden asociarse. [ 16 ] Sin embargo, diferentes enzimas de restricción generan diferentes extremos, y la composición de bases de los extremos producidos por estas enzimas también puede diferir, la temperatura de fusión y por lo tanto la temperatura óptima puede variar ampliamente dependiendo de las enzimas de restricción utilizadas, y la temperatura óptima para la ligación puede estar entre 4-15 ° C dependiendo de los extremos. [ 17 ] [ 18 ] Las ligaciones también a menudo implican la ligación de extremos generados por diferentes enzimas de restricción en la misma mezcla de reacción, por lo que puede no ser práctico seleccionar la temperatura óptima para una reacción de ligación particular y la mayoría de los protocolos simplemente eligen 12-16 ° C, temperatura ambiente o 4 ° C. Cuando se realiza una ligación a 4 ° C, es necesario aumentar el tiempo de reacción de ligación, por ejemplo dejando la mezcla de ligación durante la noche o más tiempo en el refrigerador.

Composición del tampón

La fuerza iónica del tampón utilizado puede afectar la ligación. El tipo de cationes presentes también puede influir en la reacción de ligación; por ejemplo, un exceso de Na + puede hacer que el ADN se vuelva más rígido y aumentar la probabilidad de ligación intermolecular. A altas concentraciones de cationes monovalentes (>200 mM), la ligación puede inhibirse casi por completo. [ 19 ] El tampón estándar utilizado para la ligación está diseñado para minimizar los efectos iónicos. [ 20 ]

Ligadura de extremos cohesivos

Las enzimas de restricción pueden generar una amplia variedad de extremos en el ADN que digieren, pero en los experimentos de clonación, las enzimas de restricción más utilizadas generan un saliente monocatenario de 4 bases llamado extremo cohesivo o pegajoso (las excepciones incluyen Nde I que genera un saliente de 2 bases y aquellas que generan extremos romos). Estos extremos cohesivos pueden hibridar con otros extremos compatibles y ligarse en una ligación de extremo cohesivo (o extremo pegajoso). Eco RI, por ejemplo, genera un extremo AATT, y dado que A y T tienen una temperatura de fusión más baja que C y G, su temperatura de fusión T m es baja, alrededor de 6 ° C. [ 21 ] Para la mayoría de las enzimas de restricción, los salientes generados tienen una T m que es alrededor de 15 ° C. [ 20 ] Para fines prácticos, las ligaciones de extremo cohesivo se realizan a 12-16 ° C, o a temperatura ambiente, o alternativamente a 4 ° C durante un período más largo.

Para la inserción de un fragmento de ADN en un vector plasmídico, es preferible utilizar dos enzimas de restricción diferentes para digerir el ADN y generar extremos distintos. Estos dos extremos diferentes evitan la religación del vector sin el fragmento insertado y, además, permiten insertarlo de forma direccional.

Cuando no es posible utilizar dos sitios diferentes, puede ser necesario desfosforilar el ADN del vector para evitar una alta cantidad de ADN del vector recircularizado sin inserto. Sin un grupo fosfato en los extremos, el vector no puede ligarse a sí mismo, pero sí puede ligarse a un inserto con un grupo fosfato. La desfosforilación se realiza comúnmente utilizando fosfatasa alcalina intestinal de ternera (CIAP), que elimina el grupo fosfato del extremo 5′ del ADN digerido. Sin embargo, cabe señalar que la CIAP no es fácil de inactivar y puede interferir con la ligación si no se realiza un paso adicional para eliminarla, lo que resulta en un fallo de la ligación. La CIAP no debe utilizarse en cantidades excesivas y solo debe emplearse cuando sea necesario. La fosfatasa alcalina de camarón (SAP) o la fosfatasa antártica (AP) son alternativas adecuadas, ya que pueden inactivarse fácilmente.

Ligadura de extremo romo

La ligación de extremos romos no implica el apareamiento de bases de los extremos sobresalientes, por lo que cualquier extremo romo puede ligarse a otro extremo romo. Los extremos romos pueden generarse mediante enzimas de restricción como Sma I y Eco RV . Una ventaja importante de la clonación de extremos romos es que el inserto deseado no requiere sitios de restricción en su secuencia, ya que los extremos romos generalmente se generan mediante PCR , y el fragmento de ADN de extremos romos generado por PCR puede luego ligarse a un vector de extremos romos generado a partir de una digestión con enzimas de restricción.

La ligación de extremos romos , sin embargo, es mucho menos eficiente que la ligación de extremos cohesivos; por lo general, la reacción es 100 veces más lenta. Dado que los extremos romos no presentan extremos sobresalientes, la reacción de ligación depende de colisiones aleatorias entre ellos y, en consecuencia, es mucho menos eficiente. Para compensar esta menor eficiencia, se utiliza una mayor concentración de ligasa que en la ligación de extremos cohesivos (10 veces o más). La concentración de ADN empleada en la ligación de extremos romos también es mayor para aumentar la probabilidad de colisiones entre los extremos, y se puede utilizar un tiempo de incubación más prolongado.

Si ambos extremos que deben ligarse a un vector son romos, entonces el vector debe desfosforilarse para minimizar la autoligación. Esto puede hacerse usando CIAP, pero es necesario tener precaución en su uso, como se mencionó anteriormente. Dado que el vector ha sido desfosforilado y la ligación requiere la presencia de un fosfato en 5', el inserto debe fosforilarse. El producto de PCR de extremos romos normalmente carece de un fosfato en 5', por lo que debe fosforilarse mediante tratamiento con T4 polinucleótido quinasa . [ 22 ]

La ligadura de extremos romos también se inhibe reversiblemente por altas concentraciones de ATP. [ 23 ]

La PCR suele generar productos de PCR con extremos romos, pero cabe destacar que la PCR con polimerasa Taq puede añadir una adenina (A) adicional al extremo 3' del producto. Esta propiedad puede aprovecharse en la clonación TA, donde los extremos del producto de PCR pueden hibridar con el extremo T de un vector. Por lo tanto, la ligación TA es una forma de ligación de extremos cohesivos. Los vectores con extremos romos pueden transformarse en vectores para la ligación TA con dideoxitimidina trifosfato (ddTTP) mediante transferasa terminal.

Directrices generales

Para la clonación de un inserto en un plásmido circular:

  • La concentración total de ADN utilizada debe ser inferior a 10 μg/ml, ya que el plásmido necesita recircularizarse.
  • La relación molar entre el inserto y el vector suele ser de aproximadamente 3:1. Una relación muy alta puede generar múltiples insertos. Esta relación puede ajustarse según el tamaño del inserto, y también pueden utilizarse otras relaciones, como 1:1.

Solución de problemas

En ocasiones, la ligación no produce los productos ligados deseados, y algunas de las posibles razones pueden ser:

  • ADN dañado: La sobreexposición a la radiación UV durante la preparación del ADN para la ligación puede dañarlo y reducir significativamente la eficiencia de la transformación . Se debe utilizar radiación UV de mayor longitud de onda (365  nm), que causa menos daño al ADN, si es necesario trabajar con el ADN en un transiluminador UV durante un período prolongado. Sin embargo, la adición de citidina o guanosina al tampón de electroforesis a una concentración de 1 mM puede proteger el ADN del daño. [ 24 ]
  • Uso incorrecto de CIAP o su inactivación o eliminación ineficiente.
  • Se utilizó una cantidad excesiva de ADN.
  • Digestión incompleta del ADN : El ADN del vector que no se digiere completamente dará lugar a un ruido de fondo elevado, lo que puede comprobarse realizando una ligación sin inserto como control. Un inserto que no se digiere completamente tampoco se ligará correctamente ni se circularizará. Al digerir un producto de PCR, asegúrese de que se hayan añadido suficientes bases adicionales a los extremos 5' de los oligonucleótidos utilizados para la PCR, ya que muchas enzimas de restricción requieren un número mínimo de pares de bases adicionales para una digestión eficiente. La información sobre el número mínimo de pares de bases requeridos está disponible en los proveedores de enzimas de restricción, como en el catálogo de New England Biolabs . [ 25 ]
  • Ligación incompleta: el ADN de extremos romos (por ejemplo, Sma I ) y algunos ADN de extremos cohesivos (por ejemplo, Nde I ) que tienen una temperatura de fusión baja requieren más ligasa y un tiempo de incubación más prolongado. [ 26 ]
  • La proteína expresada a partir del gen insertado mediante ligadura es tóxica para las células.
  • Secuencia homóloga en el inserto con secuencia en el ADN del plásmido que resulta en una deleción.
  • Alta concentración de EDTA o sales que actúan como inhibidores. [ 27 ]

Otros métodos de ligación de ADN

Varios kits de clonación de ADN disponibles comercialmente utilizan otros métodos de ligación que no requieren el uso de las ligasas de ADN habituales. Estos métodos permiten una clonación mucho más rápida, así como una transferencia más sencilla del ADN clonado a diferentes vectores . Sin embargo, estos métodos requieren el uso de vectores y componentes especialmente diseñados y pueden carecer de flexibilidad.

Ligación mediada por topoisomerasa

La topoisomerasa puede utilizarse en lugar de la ligasa para la ligación, y la clonación puede realizarse más rápidamente sin necesidad de digestión con enzimas de restricción del vector o inserto. En este método de clonación TOPO, un vector linealizado se activa mediante la unión de la topoisomerasa I a sus extremos, y este vector "activado por TOPO" puede entonces aceptar un producto de PCR mediante la ligación a ambos extremos 5' del producto de PCR; la topoisomerasa se libera y se forma un vector circular en el proceso. [ 28 ]

Recombinación homóloga

Otro método de clonación sin el uso de ligasa es mediante recombinación de ADN , por ejemplo, como se utiliza en el sistema de clonación Gateway . [ 29 ] [ 30 ] El gen, una vez clonado en el vector de clonación (llamado clon de entrada en este método), puede introducirse fácilmente en una variedad de vectores de expresión mediante recombinación. [ 31 ]

Ejemplos y aplicaciones de las ligasas de ADN

En los organismos estudiados se han encontrado diferentes tipos de ligasas. Por ejemplo, la ligasa dependiente de nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) se descubrió y aisló de la bacteria E. coli en el segundo tercio del siglo XX. Desde entonces, este modelo se ha utilizado ampliamente para estudiar esta familia de ligasas de ADN. Además, se encuentra en todas las bacterias. Ejemplos de genes presentes en E. coli son LigA, que tiene funciones esenciales que afectan el crecimiento bacteriano, y LigB. [ 32 ]

En mamíferos, incluidos los humanos, se identificaron 3 genes, a saber, Lig1, Lig3 y Lig4. Todos los eucariotas contienen múltiples tipos de ligasas de ADN codificadas por genes Lig. [ 33 ] La ligasa eucariota más pequeña conocida es la ligasa de ADN del virus Chlorella (ChVLig). Contiene solo 298 aminoácidos. Cuando ChVLig es la única fuente de ligasa en la célula, puede continuar apoyando el desarrollo mitótico y la unión de extremos no homólogos en levaduras en gemación. [ 34 ] La ligasa de ADN I (Lig1) es responsable de la ligación de los fragmentos de Okazaki. Está compuesta por 919 aminoácidos. En un proceso complejo de replicación del ADN, la ligasa de ADN I es reclutada a la maquinaria de replicación mediante interacciones proteicas. Lig1 juega un papel en la división celular en plantas y levaduras. La eliminación del gen Lig1 es letal en levaduras y algunos brotes de plantas. Sin embargo, estudios de embriogénesis de ratón han demostrado que hasta la mitad del proceso de crecimiento el embrión se desarrolla sin ADN ligasa I. [ 35 ]

La ligación enzimática se ha utilizado en diversos estudios relacionados con nanoestructuras de ADN y ha dado lugar a un aumento de la eficiencia y la estabilidad. Uno de los métodos consiste en el sellado de enlaces covalentes de ADN, concretamente enlaces fosfodiéster y muescas. La reconstrucción de estas estructuras se realiza con la ayuda de la ligación. Por ejemplo, la ADN ligasa T4 actúa como catalizador para sellar una muesca entre los extremos 3' y 5' del ADN para formar un enlace fosfodiéster fuerte. Las estructuras ligadas presentan valores de estabilidad térmica más elevados. [ 36 ] La ADN ligasa T4 posee muchas propiedades valiosas, como la catalítica ya mencionada, pero también es responsable del sellado de los huecos entre las hebras de ADN, la actividad de cierre de muescas, la reparación del daño en el ADN, etc. [ 2 ]

En la arquitectura de nanoestructuras, las investigaciones en biología molecular utilizan el ADN monocatenario (ssDNA) como un modelo de aplicación importante. La ADN ligasa T4 se utiliza para ciclar fragmentos cortos de ssDNA, pero el proceso se complica por la formación de estructuras secundarias. Por otro lado, la ADN ligasa Taq es una enzima termoestable que puede aplicarse a temperaturas más altas (45, 55 y 65  °C, respectivamente). Dado que en este rango de temperaturas las estructuras secundarias son menos estables, se mejora la eficiencia de la ciclización de los oligonucleótidos. Los parámetros cinéticos, biológicos y otros de las nanoestructuras se ven influenciados por la presencia de estructuras secundarias en los anillos de ADN. Sin embargo, la ligación de ADN Taq solo ocurre cuando dos hebras de ADN complementarias están perfectamente apareadas y no presentan huecos entre ellas. [ 37 ]

El análisis de las actividades, mutaciones y deficiencias de las ligasas se utiliza ampliamente en el diseño de fármacos e investigaciones biológicas para investigar enfermedades, el desarrollo de patologías y síndromes raros adquiridos o hereditarios relacionados (por ejemplo, el síndrome de la ADN ligasa IV). [ 38 ] [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ]

El procedimiento de ligación es frecuente en las técnicas de clonación de biología molecular y se ha aplicado para definir y caracterizar secuencias de nucleótidos específicas en el genoma mediante la amplificación de sondas ligadas basada en la reacción en cadena de la ligasa (LCR) o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). [ 42 ]

Análisis

La ligación también puede servir como método de análisis de ADN . [ 43 ] Algunas técnicas emplean amplificación por círculo rodante . [ 43 ] La más notable de ellas es descrita por Smolina et al. , 2007 y Smolina et al. , 2008 utilizando hibridación in situ con fluorescencia y ácidos nucleicos peptídicos . [ 43 ] Desarrollaron y emplearon esta técnica para análisis de cromosomas bacterianos. [ 43 ]

Véase también

Referencias

  1. 1 2 Shuman S (junio de 2009). "ADN ligasas: progreso y perspectivas" . The Journal of Biological Chemistry . 284 (26): 17365– 17369. doi : 10.1074/jbc.R900017200 . PMC 2719376. PMID 19329793 .  
  2. 1 2 Su T, Liu F, Chang Y, Guo Q, Wang J, Wang Q, Qi Q (junio de 2019). "La ADN ligasa del fago T4 media la reparación de roturas de doble cadena del cromosoma bacteriano como una unión de extremos no homólogos de un solo componente" . Synthetic and Systems Biotechnology . 4 (2): 107– 112. doi : 10.1016/j.synbio.2019.04.001 . PMC 6525309. PMID 31193309 .  
  3. ↑ Tomkinson AE, Naila T, Khattri Bhandari S (febrero de 2020). "Actividad de la ADN ligasa alterada en enfermedades humanas" . Mutagenesis . 35 (1): 51– 60. doi : 10.1093/mutage/gez026 . PMC 7317150. PMID 31630206 .  
  4. 1 2 Kresge N, Simoni RD, Hill RL (enero de 2007). "Perspectivas sobre la unión del ADN: I. El trabajo de Robert Lehman sobre la ADN ligasa" . The Journal of Biological Chemistry . 282 (2): e1– e3. doi : 10.1016/S0021-9258(20)73504-0 .
  5. ↑ Modorich P, Lehman IR (noviembre de 1973). "Ligasa de ácido desoxirribonucleico. Un análisis cinético en estado estacionario de la reacción catalizada por la enzima de Escherichia coli" (PDF) . The Journal of Biological Chemistry . 248 (21): 7502– 7511. PMID 4355585 . 
  6. ^ Stryer L (2007). Bioquímica (3ª ed.). Hombre libre. págs. 658 –659. ISBN   9780716787242.
  7. ↑ Saunders VA (6 de diciembre de 2012). Genética microbiana aplicada a la biotecnología : principios y técnicas de transferencia y manipulación genética . Springer. ISBN  9781461597964.
  8. ↑ Old RW , Primrose SB (27 de septiembre de 1994). Principios de manipulación genética: una introducción a la ingeniería genética (5.ª ed.). Blackwell Scientific. pág. 37. ISBN   9780632037124.
  9. ↑ Taylor MR, Conrad JA, Wahl D, O'Brien PJ (julio de 2011). "El mecanismo cinético de la ADN ligasa I humana revela cambios dependientes del magnesio en el paso limitante de la velocidad que comprometen la eficiencia de la ligación" . The Journal of Biological Chemistry . 286 (26): 23054– 23062. doi : 10.1074/jbc.m111.248831 . PMC 3123073. PMID 21561855 .  
  10. ↑ Sambrook J, Russell D. «Capítulo 1: Plásmidos y su utilidad en la clonación molecular». Clonación molecular: un manual de laboratorio . Vol. 1 (3.ª ed.). págs. 120-121 . ISBN    978-0-87969-577-4.
  11. 1 2 Rusche JR, Howard-Flanders P (marzo de 1985). "El cloruro de hexamina cobalto promueve la ligación intermolecular de fragmentos de ADN de extremo romo por la ADN ligasa T4" . Nucleic Acids Research . 13 (6): 1997– 2008. doi : 10.1093/nar/13.6.1997 . PMC 341130. PMID 4000951 .  
  12. ↑ Zimmerman SB, Pheiffer BH (octubre de 1983). "El hacinamiento macromolecular permite la ligación de extremos romos mediante ligasas de ADN de hígado de rata o Escherichia coli" . Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América . 80 (19): 5852– 5856. Bibcode : 1983PNAS...80.5852Z . doi : 10.1073/pnas.80.19.5852 . PMC 390173. PMID 6351067 .  
  13. ↑ Hayashi K, Nakazawa M, Ishizaki Y, Hiraoka N, Obayashi A (octubre de 1986). "Regulación de la ligación inter e intramolecular con la ADN ligasa T4 en presencia de polietilenglicol" . Nucleic Acids Research . 14 (19): 7617– 7631. doi : 10.1093/nar/14.19.7617 . PMC 311784. PMID 3022231 .  
  14. ↑ "Preguntas frecuentes" . NEB .
  15. ↑ "Kit de ligadura rápida" . NEB .
  16. ↑ Old RW , Primrose SB (27 de septiembre de 1994). Principios de manipulación genética: una introducción a la ingeniería genética (5.ª ed.). Blackwell Scientific. pág. 36. ISBN   9780632037124.
  17. ↑ Ferretti L, Sgaramella V (enero de 1981). "Dependencia de la temperatura de la unión por la ADN ligasa T4 de los extremos producidos por las endonucleasas de restricción de tipo II" . Nucleic Acids Research . 9 (1): 85– 93. doi : 10.1093 / nar/9.1.85 . PMC 326670. PMID 6259621 .  
  18. ↑ Dugaiczyk A, Boyer HW, Goodman HM (julio de 1975). "Ligación de fragmentos de ADN generados por la endonucleasa EcoRI en estructuras lineales y circulares". Journal of Molecular Biology . 96 (1): 171– 184. doi : 10.1016/0022-2836(75)90189-8 . PMID 169355 . 
  19. ↑ Raae AJ, Kleppe RK, Kleppe K (diciembre de 1975). "Cinética y efecto de sales y poliaminas sobre la polinucleótido ligasa T4" . European Journal of Biochemistry . 60 (2): 437– 443. doi : 10.1111/j.1432-1033.1975.tb21021.x . PMID 173544 . 
  20. 1 2 Lucotte G, Baneyx F (1993). Introducción a las técnicas de clonación molecular . Wiley-Blackwell. pág. 156. ISBN  978-0471188490.
  21. ↑Mertz JE, Davis RW (November 1972). "Cleavage of DNA by R 1 restriction endonuclease generates cohesive ends". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69 (11): 3370–3374. Bibcode:1972PNAS...69.3370M. doi:10.1073/pnas.69.11.3370. PMC 389773. PMID 4343968.
  22. ↑"Cloning Guide". New England Biolabs Inc.
  23. ↑Ferretti L, Sgaramella V (August 1981). "Specific and reversible inhibition of the blunt end joining activity of the T4 DNA ligase". Nucleic Acids Research. 9 (15): 3695–3705. doi:10.1093/nar/9.15.3695. PMC 327385. PMID 6269089.
  24. ↑Gründemann D, Schömig E (November 1996). "Protection of DNA during preparative agarose gel electrophoresis against damage induced by ultraviolet light". BioTechniques. 21 (5): 898–903. doi:10.2144/96215rr02. PMID 8922632. S2CID 32248907.
  25. ↑"Cleavage Close to the End of DNA Fragments". New England Biolabs Inc.
  26. ↑Chang EL, Ge B, Lee MA, So MA, Wang WE (2005). "Investigation of the Ligation Efficiency of NdeI Digested Fragments"(PDF). Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 7: 68–72. Retrieved 2012-10-29. (Note that this paper has an error describing NdeI as a four-base cutter.)
  27. ↑"Optimize Your DNA Ligation with 7 Must-Have Tips - US". www.thermofisher.com. Retrieved 2023-01-10.
  28. ↑"The Technology Behind TOPO® Cloning". Invitrogen.
  29. ↑Esposito D, Garvey LA, Chakiath CS (2009). "Gateway cloning for protein expression". High Throughput Protein Expression and Purification. Methods in Molecular Biology. Vol. 498. pp. 31–54. doi:10.1007/978-1-59745-196-3_3. ISBN 978-1-58829-879-9. PMID 18988017 . 
  30. ↑ "Métodos de clonación - Sistemas de clonación por recombinación" . EMBL .
  31. ↑ "Tecnología de clonación por recombinación Gateway®" . Invitrogen .
  32. ↑ Sriskanda V, Shuman S (diciembre de 2001). "Una segunda ligasa de ADN dependiente de NAD(+) (LigB) en Escherichia coli" . Nucleic Acids Research . 29 (24): 4930– 4934. doi : 10.1093 / nar/29.24.4930 . PMC 97608. PMID 11812821 .  
  33. ↑ Sun L, Liu X, Song S, Feng L, Shi C, Sun Z, et al. (12 de noviembre de 2021). " Identificación de LIG1 y LIG3 como biomarcadores pronósticos en el cáncer de mama" . Open Medicine . 16 (1): 1705– 1717. doi : 10.1515/med-2021-0388 . PMC 8590111. PMID 34825062 .   
  34. ↑ Samai P, Shuman S (abril de 2011). "Disección funcional de la interfaz del ADN del dominio de nucleotidiltransferasa de la ADN ligasa del virus Chlorella" . The Journal of Biological Chemistry . 286 (15): 13314– 13326. doi : 10.1074/jbc.M111.226191 . PMC 3075678. PMID 21335605 .  
  35. ↑ Waterworth WM, Kozak J, Provost CM, Bray CM, Angelis KJ, West CE (junio de 2009). "Las plantas deficientes en ADN ligasa 1 muestran graves defectos de crecimiento y reparación retardada de roturas de cadena simple y doble de ADN" . BMC Plant Biology . 9 (1): 79. Bibcode : 2009BMCPB...9...79W . doi : 10.1186 / 1471-2229-9-79 . PMC 2708163. PMID 19558640 .  
  36. ↑ Bai T, Zhang J, Huang K, Wang W, Chen B, Li Y, et al. (agosto de 2022). "Reconfiguración de nanoestructuras de ADN inducida por tratamiento de ligación enzimática" . Nucleic Acids Research . 50 (14): 8392– 8398. doi : 10.1093/nar/ gkac606 . PMC 9371897. PMID 35880584 .   
  37. ↑ Lei C, Li SY, Liu JK, Zheng X, Zhao GP, Wang J (mayo de 2017). "El método CCTL (corte asistido por Cpf1 y ligación asistida por Taq ADN ligasa) para la edición eficiente de grandes construcciones de ADN in vitro" . Nucleic Acids Research . 45 (9): e74. doi : 10.1093/nar/gkx018 . PMC 5436000. PMID 28115632 .  
  38. ↑ Huang M, Dong G, Lu X, Xiao F, Zhou Q, Zhang S (octubre de 2022). "Deficiencia de ADN ligasa IV con niveles elevados de IgG sérica con sospecha de síndrome mielodisplásico: informe de un caso" . BMC Pediatrics . 22 (1) 588. doi : 10.1186/s12887-022-03655-x . PMC 9552496. PMID 36221079 .  
  39. ↑ Altmann T, Gennery AR (octubre de 2016). "Síndrome de la ligasa IV del ADN; una revisión" . Orphanet Journal of Rare Diseases . 11 (1) 137. doi : 10.1186/s13023-016-0520-1 . PMC 5055698. PMID 27717373 .  
  40. ↑ Chen X, Zhong S, Zhu X, Dziegielewska B, Ellenberger T, Wilson GM, et al. (mayo de 2008). "Diseño racional de inhibidores de la ADN ligasa humana que se dirigen a la replicación y reparación del ADN celular" . Cancer Research . 68 (9): 3169– 3177. doi : 10.1158/0008-5472.can-07-6636 . PMC 2734474. PMID 18451142 .   
  41. ↑ Enders A, Fisch P, Schwarz K, Duffner U, Pannicke U, Nikolopoulos E, et al. (abril de 2006). "Una forma grave de inmunodeficiencia combinada humana debida a mutaciones en la ADN ligasa IV". Journal of Immunology . 176 (8): 5060– 5068. doi : 10.4049/jimmunol.176.8.5060 . hdl : 1885/25570 . PMID 16585603. S2CID 1342869 .   
  42. ↑ Lohman GJ, Zhang Y, Zhelkovsky AM, Cantor EJ, Evans TC (febrero de 2014). "Ligación eficiente de ADN en hélices híbridas de ADN-ARN por la ADN ligasa del virus Chlorella" . Nucleic Acids Research . 42 (3): 1831– 1844. doi : 10.1093 / nar/gkt1032 . PMC 3919565. PMID 24203707 .  
  43. 1 2 3 4 Conze T, Shetye A, Tanaka Y, Gu J, Larsson C, Göransson J, et al. (2009-07-19). "Análisis de genes, transcripciones y proteínas mediante ligación de ADN". Annual Review of Analytical Chemistry . 2 (1). Annual Reviews : 215–239 . Bibcode : 2009ARAC....2..215C . doi : 10.1146/annurev-anchem-060908-155239 . PMID 20636060 .