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Articulo de referencia

ADN polimerasa I

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La ADN polimerasa I (o Pol I ) es una enzima que participa en el proceso de replicación del ADN procariota . Descubierta por Arthur Kornberg en 1956, [ 1 ] fue la primera ADN polimerasa conocida (y la primera polimerasa conocida de cualquier tipo ). Se caracterizó inicialmente en E. coli y es ubicua en procariotas . En E. coli y muchas otras bacterias, el gen que codifica la Pol I se conoce como polA . La enzima Pol I de E.  coli está compuesta por 928 aminoácidos y es un ejemplo de enzima procesiva : puede catalizar secuencialmente múltiples pasos de polimerización sin liberar la plantilla de cadena simple. [ 2 ] La función fisiológica de la Pol I es principalmente apoyar la reparación del ADN dañado, pero también contribuye a conectar los fragmentos de Okazaki eliminando los cebadores de ARN y reemplazando los ribonucleótidos con ADN.

Descubrimiento

En 1956, Arthur Kornberg y sus colegas descubrieron la Pol I utilizando extractos de Escherichia coli ( E. coli ) para desarrollar un ensayo de síntesis de ADN. Los científicos añadieron timidina marcada con 14C para poder recuperar un polímero radiactivo de ADN, no de ARN. Para iniciar la purificación de la ADN polimerasa, los investigadores añadieron sulfato de estreptomicina al extracto de E. coli . Esto separó el extracto en un sobrenadante libre de ácidos nucleicos (fracción S) y un precipitado que contenía ácidos nucleicos (fracción P). La fracción P también contenía Pol I y factores termoestables esenciales para las reacciones de síntesis de ADN. Estos factores se identificaron como nucleósido trifosfatos , los bloques de construcción de los ácidos nucleicos. La fracción S contenía múltiples desoxinucleósido quinasas . [ 3 ] En 1959, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue otorgado a Arthur Kornberg y Severo Ochoa "por su descubrimiento de los mecanismos involucrados en la síntesis biológica del ácido ribonucleico y el ácido desoxirribonucleico ". [ 4 ]

Arthur Kornberg 1969

Estructura y función

Estructura general

La Pol I funciona principalmente en la reparación del ADN dañado. Estructuralmente, la Pol I es un miembro de la superfamilia de proteínas alfa/beta, que abarca proteínas en las que las hélices α y las hebras β se presentan en secuencias irregulares. La ADN Pol I de E. coli consta de múltiples dominios con tres actividades enzimáticas distintas. Tres dominios, a menudo denominados dominio pulgar, dedo y palma, trabajan juntos para mantener la actividad de la ADN polimerasa. [ 5 ] Un cuarto dominio, junto al dominio palma, contiene un sitio activo de exonucleasa que elimina los nucleótidos incorporados incorrectamente en dirección 3' a 5' en un proceso conocido como corrección de pruebas. Un quinto dominio contiene otro sitio activo de exonucleasa que elimina ADN o ARN en dirección 5' a 3' y es esencial para la eliminación del cebador de ARN durante la replicación del ADN o del ADN durante los procesos de reparación del ADN.

La bacteria E. coli produce 5 polimerasas de ADN diferentes: ADN Pol I, ADN Pol II, ADN Pol III, ADN Pol IV y ADN Pol V. [ 6 ]

Similitud estructural y funcional con otras polimerasas

En la replicación del ADN, la cadena principal de ADN se extiende continuamente en la dirección del movimiento de la horquilla de replicación, mientras que la cadena rezagada de ADN corre discontinuamente en la dirección opuesta como fragmentos de Okazaki . [ 7 ] Las ADN polimerasas tampoco pueden iniciar cadenas de ADN, por lo que deben ser iniciadas por segmentos cortos de ARN o ADN conocidos como cebadores. [ 5 ] Para que tenga lugar la polimerización del ADN, deben cumplirse dos requisitos. En primer lugar, todas las ADN polimerasas deben tener tanto una cadena molde como una cadena cebadora. A diferencia del ARN, las ADN polimerasas no pueden sintetizar ADN a partir de una cadena molde. La síntesis debe ser iniciada por un segmento corto de ARN, conocido como cebador de ARN , sintetizado por la primasa en la dirección 5' a 3'. La síntesis de ADN entonces ocurre por la adición de un dNTP al grupo hidroxilo 3' en el extremo de la cadena de ADN preexistente o del cebador de ARN. En segundo lugar, las ADN polimerasas solo pueden agregar nuevos nucleótidos a la cadena preexistente a través de enlaces de hidrógeno. [ 6 ] Dado que todas las ADN polimerasas tienen una estructura similar, todas comparten un mecanismo de polimerización catalizado por dos iones metálicos. Uno de los iones metálicos activa el grupo hidroxilo 3' del cebador, que luego ataca el fosfato 5' primario del dNTP. El segundo ion metálico estabiliza la carga negativa del oxígeno saliente y, posteriormente, quelata los dos grupos fosfato salientes. [ 8 ]

The X-ray crystal structures of polymerase domains of DNA polymerases are described in analogy to human right hands. All DNA polymerases contain three domains. The first domain, which is known as the "fingers domain", interacts with the dNTP and the paired template base. The "fingers domain" also interacts with the template to position it correctly at the active site.[9] Known as the "palm domain", the second domain catalyses the reaction of the transfer of the phosphoryl group. Lastly, the third domain, which is known as the "thumb domain", interacts with double stranded DNA.[10] The exonuclease domain contains its own catalytic site and removes mispaired bases. Among the seven different DNA polymerase families, the "palm domain" is conserved in five of these families. The "finger domain" and "thumb domain" are not consistent in each family due to varying secondary structure elements from different sequences.[9]

Function

Pol I possesses four enzymatic activities:

  1. A 5'→3' (forward) DNA-dependent DNA polymerase activity, requiring a 3' primer site and a template strand
  2. A 3'→5' (reverse) exonuclease activity that mediates proofreading
  3. A 5'→3' (forward) exonuclease activity mediating nick translation during DNA repair.
  4. A 5'→3' (forward) RNA-dependent DNA polymerase activity. Pol I operates on RNA templates with considerably lower efficiency (0.1–0.4%) than it does DNA templates, and this activity is probably of only limited biological significance.[11]

In order to determine whether Pol I was primarily used for DNA replication or in the repair of DNA damage, an experiment was conducted with a deficient Pol I mutant strain of E. coli. The mutant strain that lacked Pol I was isolated and treated with a mutagen. The mutant strain developed bacterial colonies that continued to grow normally and that also lacked Pol I. This confirmed that Pol I was not required for DNA replication. However, the mutant strain also displayed characteristics which involved extreme sensitivity to certain factors that damaged DNA, like UV light. Thus, this reaffirmed that Pol I was more likely to be involved in repairing DNA damage rather than DNA replication.[6]

Mechanism

En el proceso de replicación, la RNasa H elimina el cebador de ARN (creado por la primasa ) de la hebra rezagada y, a continuación, la polimerasa I rellena los nucleótidos necesarios entre los fragmentos de Okazaki (véase replicación del ADN ) en dirección 5'→3', corrigiendo errores a medida que avanza. Es una enzima dependiente de plantilla: solo añade nucleótidos que se aparean correctamente con una hebra de ADN existente que actúa como plantilla. Es crucial que estos nucleótidos tengan la orientación y geometría adecuadas para aparearse con la hebra de ADN plantilla, de modo que la ADN ligasa pueda unir los distintos fragmentos en una hebra continua de ADN . Estudios sobre la polimerasa I han confirmado que diferentes dNTP pueden unirse al mismo sitio activo de la polimerasa I. La polimerasa I es capaz de discriminar activamente entre los diferentes dNTP solo después de sufrir un cambio conformacional . Una vez que se ha producido este cambio, la Pol I comprueba la geometría y la alineación correctas del par de bases formado entre el dNTP unido y una base correspondiente en la hebra plantilla. La geometría correcta de los pares de bases A=T y G≡C es la única que puede encajar en el sitio activo . Sin embargo, es importante saber que uno de cada 10⁴ a 10⁵ nucleótidos se añade incorrectamente. No obstante, la Pol I puede corregir este error en la replicación del ADN mediante su método selectivo de discriminación activa. [ 5 ]

A pesar de su caracterización temprana, pronto se hizo evidente que la polimerasa I no era la enzima responsable de la mayor parte de la síntesis de ADN: la replicación del ADN en E. coli procede a aproximadamente 1000 nucleótidos/segundo, mientras que la tasa de síntesis de pares de bases por la polimerasa I promedia solo entre 10 y 20 nucleótidos/segundo. Además, su abundancia celular de aproximadamente 400 moléculas por célula no se correlacionaba con el hecho de que normalmente solo hay dos horquillas de replicación en E. coli . Adicionalmente, es insuficientemente procesiva para copiar un genoma completo , ya que se descompone después de incorporar solo 25-50 nucleótidos . Su papel en la replicación se demostró cuando, en 1969, John Cairns aisló un mutante viable de polimerasa I que carecía de actividad polimerasa. [ 12 ] La asistente de laboratorio de Cairns, Paula De Lucia, creó miles de extractos libres de células de colonias de E. coli y los analizó para detectar la actividad de la ADN polimerasa. El clon número 3478 contenía el mutante polA , que fue nombrado por Cairns en honor a "Paula" [De Lucia]. [ 13 ] No fue hasta el descubrimiento de la ADN polimerasa III que finalmente se identificó la principal ADN polimerasa replicativa.

Aplicaciones de investigación

ADN polimerasa I: Fragmento de Klenow (PDB 1KLN EBI) [ 14 ]

La ADN polimerasa I obtenida de E. coli se utiliza ampliamente en la investigación de biología molecular . Sin embargo, su actividad exonucleasa 5'→3' la hace inadecuada para muchas aplicaciones. Esta actividad enzimática indeseable puede eliminarse fácilmente de la holoenzima para dejar una molécula útil llamada fragmento de Klenow , ampliamente utilizada en biología molecular . De hecho, el fragmento de Klenow se utilizó durante los primeros protocolos de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) hasta que se descubrió Thermus aquaticus , la fuente de una Taq polimerasa I termotolerante , en 1976. [ 15 ] La exposición de la ADN polimerasa I a la proteasa subtilisina escinde la molécula en un fragmento más pequeño, que conserva solo las actividades de ADN polimerasa y corrección de errores.

Véase también

Referencias

  1. ↑ Lehman IR, Bessman MJ, Simms ES, Kornberg A (julio de 1958). "Síntesis enzimática de ácido desoxirribonucleico. I. Preparación de sustratos y purificación parcial de una enzima de Escherichia coli " . The Journal of Biological Chemistry . 233 (1): 163–70 . doi : 10.1016/S0021-9258(19)68048-8 . PMID 13563462 . 
  2. ^ Voet D, Voet JG, Pratt CW (1999). Fundamentos de Bioquímica . Nueva York: Wiley.
  3. ↑ Lehman IR (septiembre de 2003). "Descubrimiento de la ADN polimerasa" . The Journal of Biological Chemistry . 278 (37): 34733–8 . doi : 10.1074/jbc.X300002200 . PMID 12791679 . 
  4. ↑ "El Premio Nobel de Fisiología o Medicina de 1959" . www.nobelprize.org . Consultado el 8 de noviembre de 2016 .
  5. 1 2 3 Cox MM, Doudna J (2015). Biología molecular (2.ª ed.). Nueva York: WH Freeman. 
  6. 1 2 3 Cooper, Geoffrey M. Geoffrey (2000-01-01). "Replicación del ADN" . Sinauer Associates.{{cite journal}}: Para citar una revista se requiere |journal=( ayuda )
  7. ^ Hübscher U, Spadari S, Villani G, Maga G (2010). ADN polimerasas . doi : 10.1142/7667 . ISBN 978-981-4299-16-9.
  8. ↑ "ADN polimerasa I: Reacciones enzimáticas" .
  9. 1 2 "MBIO.4.14.5" . bioscience.jbpub.com . Archivado del original el 30-09-2017 . Recuperado el 14-05-2017 .
  10. ↑ Loeb LA, Monnat RJ (agosto de 2008). "ADN polimerasas y enfermedades humanas". Nature Reviews Genetics . 9 (8): 594– 604. doi : 10.1038/nrg2345 . PMID 18626473. S2CID 3344014 .  
  11. ↑ Ricchetti M, Buc H (febrero de 1993). " La ADN polimerasa I de E. coli como transcriptasa inversa" . The EMBO Journal . 12 (2): 387–96 . doi : 10.1002/j.1460-2075.1993.tb05670.x . PMC 413221. PMID 7679988 .  
  12. ↑ De Lucia P, Cairns J (diciembre de 1969). "Aislamiento de una cepa de E. coli con una mutación que afecta a la ADN polimerasa". Nature . 224 ( 5225): 1164– 6. Bibcode : 1969Natur.224.1164D . doi : 10.1038/2241164a0 . PMID 4902142. S2CID 4182917 .  
  13. ↑ Friedberg EC (febrero de 2006). "La enzima eureka: el descubrimiento de la ADN polimerasa". Nature Reviews Molecular Cell Biology . 7 (2): 143– 7. doi : 10.1038/nrm1787 . PMID 16493419. S2CID 39605644 .  
  14. ↑ EMBL-EBI. "Instituto Europeo de Bioinformática EMBL" . www.ebi.ac.uk. Consultado el 8 de noviembre de 2016 .
  15. ↑ van Pelt-Verkuil E, van Belkum A, Hays JP (2008). "Taq y otras ADN polimerasas termoestables". Principios y aspectos técnicos de la amplificación por PCR . págs. 103–18 . doi : 10.1007/978-1-4020-6241-4_7 . ISBN  978-1-4020-6240-7.