Despirogenación

La detección temprana de endotoxinas se lograba inyectando la muestra a conejos y observando la respuesta en su temperatura corporal. Los conejos tienen una tolerancia a las endotoxinas similar a la de los humanos, por lo que eran una opción ideal. Sin embargo, este método era costoso, requería mucho tiempo y provocó protestas de defensores de los derechos de los animales. Pero quizás el mayor inconveniente de esta prueba era su incapacidad para cuantificar el nivel de endotoxinas.

Actualmente, un método común para la detección de endotoxinas es la prueba de lisado de amebocitos de Limulus (LAL). Esta prueba se basa en la observación del Dr. Frederik Bang de que la sangre del cangrejo herradura forma coágulos cuando se expone a endotoxinas. ^{[ 1 ]} El extracto de amebocitos de la sangre del cangrejo herradura se mezcla con una muestra sospechosa de contaminación por endotoxinas, y se observa una reacción si hay endotoxinas presentes. La FDA ha aprobado cuatro variantes de la prueba LAL: gel-coágulo, turbidimétrica, colorimétrica y cromogénica. Las diferencias entre estas variantes se refieren a las características de la reacción amebocitos/endtoxinas (por ejemplo, el gel-coágulo produce un precipitado y el colorimétrico cambia de color). Esta prueba es rápida (aproximadamente 30 minutos) y altamente sensible (hasta 0,001 EU/ml de sensibilidad). Sin embargo, debido a que solo detecta endotoxinas LPS, algunos materiales pirógenos pueden pasar desapercibidos. Además, ciertas condiciones (condiciones de pH subóptimas o concentración de cationes inadecuada ) pueden provocar falsos negativos. Los glucanos de las matrices de cromatografía de carbohidratos también pueden provocar falsos positivos. ^{[ 2 ]}

Desde 2003, se comercializa un sustituto sintético para la prueba LAL. Esta prueba de factor C recombinante (rFC) se basa en el factor de coagulación C de Limulus , la parte sensible al LPS de la prueba LAL. La adopción de esta prueba fue lenta, situación que comenzó a cambiar en 2016 cuando la Farmacopea Europea la incluyó como prueba de toxinas bacterianas aceptada. ^{[ 3 ]}

La prueba de activación de monocitos (MAT) utiliza los monocitos de la sangre humana in vitro para detectar pirógenos. Se incorporó a la Farmacopea Europea en 2010 y fue aceptada por la FDA en 2012. ^{[ 4 ]}

Las endotoxinas tienen carga negativa y se unen a un intercambiador de aniones . Si la sustancia objetivo no tiene también carga negativa, pasará a través de la columna antes que la endotoxina, lo que permite una separación eficaz. Este método se utiliza a veces en la purificación de albúminas (véase más adelante). Se pueden acoplar ligandos con afinidad conocida por las endotoxinas a un sistema de intercambio de aniones para aumentar su afinidad y mejorar aún más la pureza del producto final. Algunos ejemplos típicos de ligandos que se unen a las endotoxinas son la histamina , los compuestos heterocíclicos nitrogenados y la polimixina B. Sin embargo, se sabe que la polimixina B induce la producción de interleucina-1, un pirógeno exógeno, por lo que debe demostrarse su ausencia en el producto final si se utiliza.

Ejemplo de uso de cromatografía de intercambio aniónico para purificar albúmina: ^{[ 6 ]}

• El 2% de la endotoxina no se adhiere a la columna. Sin embargo, este 2% se elimina antes del pico de albúmina, por lo que puede retirarse simplemente iniciando la recolección una vez que este 2% se haya eliminado.
• El 10 % de la endotoxina que se adhiere a la columna (9,8 % del total original) se eliminará posteriormente tras alcanzar el pico de albúmina. Esto puede evitarse deteniendo la recolección antes de que esto ocurra, impidiendo que la endotoxina llegue al producto final.
• El 90% restante de la endotoxina unida (88,2% del total original) debe eliminarse de la columna utilizando NaOH.

Una alternativa al intercambio aniónico es la cromatografía de intercambio catiónico , en la que los solutos con carga positiva se unen al medio cromatográfico sólido. En este método, el analito se une a la columna en lugar de la endotoxina. La endotoxina se elimina a través de la columna y, posteriormente, se eluye el analito puro. Se ha demostrado que la cromatografía de intercambio catiónico purifica eficazmente el interferón β. (Dembinski, et al.) ^{[ 7 ]}

Dado que el peso molecular de las endotoxinas suele ser superior a 10 kD, la ultrafiltración puede utilizarse en ocasiones para realizar una separación por tamaño. Debido a la gran variabilidad del tamaño de las endotoxinas, puede resultar difícil seleccionar la membrana adecuada; por lo tanto, este método se recomienda utilizar únicamente cuando todas las endotoxinas presentes superan los 300 000 Da. Se ha demostrado que los ultrafiltros disponibles comercialmente eliminan los pirógenos hasta niveles inferiores a 0,001 EU/ml.

Este método también se basa en el elevado peso molecular y la estabilidad térmica de las endotoxinas. Los disolventes de bajo peso molecular se pueden purificar fácilmente hirviéndolos y recogiendo el vapor condensado en un recipiente libre de endotoxinas (véase «calentamiento» más adelante). Las grandes moléculas de LPS no se vaporizan fácilmente y, por lo tanto, permanecen en el recipiente de calentamiento. Este es el método preferido para la purificación del agua.

Se ha demostrado que este método escinde el lípido A del polisacárido en la molécula de LPS (véase a la derecha). La porción lipídica por sí sola no es soluble en agua. Por lo tanto, al no poder unirse a las células endoteliales , se vuelve inactiva. Sin embargo, la hidrólisis ácido-base puede desnaturalizar una proteína diana y, por consiguiente, no es adecuada para la purificación de proteínas.

La oxidación con peróxido de hidrógeno se utiliza frecuentemente como una solución de bajo costo para eliminar pirógenos. Se desconoce el mecanismo de esta eliminación, pero el peróxido de hidrógeno se puede eliminar fácilmente en etapas posteriores del proceso de purificación, por lo que resulta un método útil para la eliminación de pirógenos. Sin embargo, al igual que la hidrólisis ácido-base, no es adecuada para la purificación de proteínas.

Los métodos de calentamiento se utilizan frecuentemente para garantizar que el vidrio y otros equipos de laboratorio estén libres de material pirógeno. El calor se aplica mediante un horno de calor seco diseñado específicamente para el proceso de despirogenación. Si bien las endotoxinas son relativamente estables térmicamente, un calentamiento suficiente (250  °C durante 30 minutos) produce una reducción de 3 logaritmos en sus niveles. Debido a las altas temperaturas, este método tampoco es adecuado para la purificación de proteínas.

Para la purificación de proteínas, se pueden utilizar álcalis como el hidróxido de sodio (NaOH) de forma segura y eficaz. También se emplea ampliamente para la despirogenación de equipos no autoclavables (por ejemplo, plásticos) y columnas de cromatografía. De hecho, al utilizar un intercambiador aniónico para eliminar pirógenos, es necesario limpiar la columna con NaOH después de cada lote.