lisado de amebocitos de Limulus

Uno de los aspectos que más tiempo consume en las pruebas de endotoxinas mediante LAL es el pretratamiento de las muestras para superar la inhibición del ensayo que puede interferir con la prueba LAL y afectar la recuperación de endotoxinas. Si el producto que se está probando provoca una recuperación de endotoxinas menor a la esperada, se considera un inhibidor de la prueba LAL. Los productos que provocan valores mayores a los esperados se consideran potenciadores. La FDA exige superar las propiedades de inhibición y potenciación de un producto como parte de la validación de la prueba LAL para su uso en las pruebas de liberación final de inyectables y dispositivos médicos. Se debe comprobar una recuperación adecuada de endotoxinas antes de que se pueda utilizar LAL para la liberación del producto. ^{[ 11 ]}

La prueba LAL es una fuente importante de dependencia de productos de origen animal en la industria biomédica y un desafío para las Tres R de la ciencia en relación con el uso de animales en las pruebas. Ante los informes de tasas de mortalidad superiores a las previstas ^{[ 7 ],} se ha considerado más ético idear alternativas a la prueba. ^{[ 12 ]} Desde 2003, se comercializa un sustituto de proteína recombinante para su uso en la prueba LAL. Denominado ensayo de factor C recombinante (rFC), se basa en la misma proteína del factor de coagulación C de Limulus , pero se produce mediante células de insectos modificadas genéticamente (la secuencia específica del factor C utilizada no necesariamente proviene del cangrejo herradura del Atlántico). ^{[ 5 ]}

En lugar de emular toda la vía de coagulación, las pruebas rFC permiten que el factor C escinda un sustrato fluorogénico sintético , de modo que la muestra se ilumina cuando la endotoxina activa el factor. Dado que no contiene factor G, el (1,3)-β-D-glucano no causará falsos positivos . Hasta 2018, la evidencia disponible muestra que la prueba rFC no es peor que la prueba LAL. ^{[ 13 ]}

La adopción de la prueba rFC fue lenta, situación que comenzó a cambiar en 2012 cuando la FDA de EE. UU. y el Ministerio de Salud europeo la reconocieron como una alternativa aceptada. Su falta de mención en las farmacopeas siguió siendo un problema, ya que no existía un buen estándar para realizar la prueba en la producción. ^{[ 13 ]} En 2016, se añadió a la Farmacopea Europea . ^{[ 5 ]} Una patente sobre rFC también limitó su adopción hasta su vencimiento en 2018. ^{[ 13 ]}

El 1 de junio de 2020, la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) decidió cancelar la propuesta de incluir la tecnología recombinante para la detección de endotoxinas en el capítulo 85, Endotoxinas bacterianas , e iniciar el desarrollo de un capítulo aparte que amplíe el uso, la validación y la comparabilidad de las pruebas de endotoxinas basadas en reactivos derivados de la tecnología recombinante. La USP propuso un capítulo aparte, el 1085.1, únicamente con fines orientativos, aunque los comentarios y las opiniones publicadas el 11 de diciembre de 2020 muestran que las compañías farmacéuticas y la FDA no apoyaron este capítulo y solicitaron su inclusión en la farmacopea. ^{[ 14 ]}

En respuesta, la USP desarrolló posteriormente el Capítulo General <86>, Prueba de Endotoxinas Bacterianas con Reactivos Recombinantes, que establece los requisitos farmacopeicos para la prueba de endotoxinas utilizando reactivos no derivados de animales, como el factor C recombinante (rFC). El Capítulo <86> se oficializó en la USP-NF en mayo de 2025, estableciendo el rFC como una alternativa reconocida farmacopeicamente a la prueba de lisado de amebocitos de Limulus. ^{[ 15 ]}

La prueba de activación de monocitos (MAT) es otro método propuesto para detectar endotoxinas basado en monocitos de sangre humana . Mide la liberación de citocinas por parte de estos debido a la presencia de pirógenos , replicando básicamente el proceso por el cual estas toxinas causan fiebre en humanos (y conejos, como en la prueba de pirógenos original). ^{[ 16 ]} En la Farmacopea Europea se describe un protocolo para la prueba MAT, utilizando células cultivadas. ^{[ 17 ]}

Un estudio reciente que empleó monocitos modificados genéticamente logró mejorar significativamente la sensibilidad de los ensayos de detección basados ​​en monocitos, reduciendo el tiempo de finalización del ensayo de más de 20 horas a 2-3 horas. ^{[ 18 ]}